环状RNA circ_0120051通过miR-144-3p/IDH2轴抑制心肌成纤维细胞的纤维化表型研究

目的研究环形 RNA circ_0120051对心肌成纤维细胞的纤维化表型的调控作用和机制。方法通过实时萤光定量PCR（RT-qPCR）检测健康器官捐献者（n=24）与心力衰竭（HF）病人（n=21）心肌标本中 circ_0120051及其宿主基因溶质载体家族8成员A1（SLC8A1）的表达水平。核糖核酸外切酶（RNase R）消化实验鉴定circ_0120051的RNA稳定性。RT-qPCR检测circ_0120051在人心肌细胞AC16中的核质分布情况。利用腺病毒在C57BL/6乳小鼠心肌成纤维细胞（mCFs）中过表达circ_0120051，通过RT-qPCR和Western blot检测过表达circ_0120051对mCFs中纤维化相关基因表达的影响，利用细胞划痕实验检测对mCFs迁移能力的影响。通过RNA免疫共沉淀技术（RIP）验证circ_0120051与miR-144-3p间的结合作用，利用双萤光素酶报告基因实验鉴定miR-144-3p与靶基因异柠檬酸脱氢酶2（Idh2） 3’-UTR的结合位点。结果Circ_0120051在心衰病人心肌中表达显著增加，而其宿主基因SLC8A1表达无显著差异。Circ_0120051主要定位于人心肌细胞的胞质中。RNase R消化实验证实circ_0120051相对于线性SLC8A1 mRNA具有典型的环状RNA稳定性。过表达circ_0120051可抑制mCFs中纤维化相关基因表达和mCFs的迁移能力。RIP实验证实circ_0120051与miR-144-3p之间具有明显结合作用。在mCFs中转染miR-144-3p可促进纤维化相关基因的表达，并有效逆转circ_0120051对mCFs纤维化表型的抑制作用。双萤光素酶报告基因实验证实miR-144-3p与Idh2的3’-UTR存在结合作用。miR-144-3p可在转录水平抑制mCFs中Idh2表达，而过表达circ_0120051可增加mCFs中IDH2表达。在mCFs中转染miR-144-3p和Idh2的小干扰RNA（siRNA），可一致性地逆转circ_0120051对纤维化相关基因表达和mCFs迁移的抑制作用。结论Circ_0120051通过特异结合miR-144-3p并增加其靶基因IDH2表达来发挥抑制mCFs纤维化表型的作用

CircRNA_100395通过结合miR-144-3p抑制心肌成纤维细胞中纤维化相关基因的表达

【目的】研究环形 RNA circRNA_100395 调节心肌成纤维细胞中纤维化相关基因表达的作用机制。【方法】CircRNAs 表达谱芯片分析结合实时荧光定量 PCR 验证 circRNA_100395 在长期持续性房颤（AF）病人左心耳组织中的表达。检测血管紧张素Ⅱ（Ang-Ⅱ）诱导人心房肌成纤维细胞（HAFs）中circRNA_100395 的表达及在细胞核质中分布情况。利用放线菌素D 实验检测circRNA_100395 的RNA 稳定性。制备重组circRNA_100395 腺病毒（rAd-circRNA_100395）并感染 HAFs，检测 HAFs 中纤维化相关基因 Col1a1、Col3a1 和 Acta2 的 mRNA 和蛋白表达。通过双荧光素酶报告基因实验和RNA pull-down 实验分别鉴定circRNA_100395 与微小RNA miR-144-3p 的结合作用。【结果】Masson 染色结果显示 AF 病人心耳组织的纤维化明显加重（P < 0.01）。CircRNA_100395 在AF 患者心耳组织中表达降低（P < 0.05），但在Ang-Ⅱ诱导的HAFs 中表达明显升高（P < 0.05），且主要分布于HAFs 细胞质内。放线菌素D 实验证明 circRNA_100395 的 RNA 稳定性明显高于其宿主基因 KLHL20 mRNA。过表达circRNA_100395 抑制 HAFs 中纤维化相关基因表达。双荧光素酶报告基因实验和 RNA Pull-down 实验均证实circRNA_100395 与miR-144-3p 存在特异性的结合作用。CircRNA_100395 可抑制miR-144-3p 促HAFs 中纤维化相关基因表达的作用。【结论】CircRNA_100395 通过特异结合miR-144-3p 来发挥抑制纤维化相关基因表达的作用

PTBP1介导长链非编码RNA RP11-879F14.2发挥抑制心肌纤维化的作用

目的研究长链非编码RNA（lncRNA）RP11-879F14.2调控心肌成纤维细胞纤维化表型的作用及机制。方法对心衰患者及健康对照者心肌组织进行Masson染色检测心肌胶原水平。lncRNA表达谱芯片检测心衰患者及健康对照者心肌中lncRNAs的表达变化，实时定量荧光PCR（RT-qPCR）验证RP11-879F14.2在心衰患者心肌中的表达。利用重组RP11-879F14.2腺病毒（rAd-RP11-879F14.2）感染人心房肌成纤维细胞（HAFs），检测纤维化相关基因Col1a1，Col3a1和Acta2表达。RT-qPCR检测HAFs的核/质组分中RP11-879F14.2的水平。基于生物信息学预测和双荧光素酶报告基因实验鉴定RP11-879F14.2与多聚嘧啶区结合蛋白（PTBP1）的结合作用。检测敲低HAFs中PTBP1表达对RP11-879F14.2调控心肌纤维化相关基因表达的影响。结果Masson染色结果显示，心衰病人心肌组织发生明显纤维化。RT-qPCR结果证实RP11-879F14.2在心衰患者心肌组织中表达增加（P&lt;0.01）。过表达RP11-879F14.2可在RNA及蛋白水平显著抑制心肌纤维化相关基因表达。核质分离及RT-qPCR检测结果证实RP11-879F14.2 主要分布于细胞核中。RP11-879F14.2可与PTBP1结合，并促进HAFs中PTBP1表达，而敲低PTBP1可逆转RP11-879F14.2抑制HAFs中纤维化相关基因表达的作用。结论PTBP1可介导RP11-879F14.2发挥抑制心肌纤维化的作用

CircSLC8A1_005通过编码蛋白抑制心肌成纤维细胞纤维化表型的作用

目的探究环形RNA circSLC8A1_005调控心肌成纤维细胞纤维化表型的作用及可能机制。方法利用腺病毒介导在小鼠心肌成纤维细胞（mCFs）中过表达circSLC8A1_005，并检测mCFs中纤维化相关因I型胶原α1链（Col1a1）、Ⅲ型胶原α1链（Col3a1）和平滑肌肌动蛋白α2（Acta2）基因表达，通过EdU和划痕实验检测不同干预对mCFs的增殖和迁移能力的影响。双萤光素酶报告基因实验检测circSLC8A1_005包含的潜在核糖体进入序列（IRES）的活性。通过Western blot实验检测circSLC8A1_005翻译蛋白SLC8A1-605aa及其在细胞内分布情况。双萤光素酶报告基因实验检测SLC8A1-605aa对超氧化物歧化酶2（Sod2）的转录激活作用。通过RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验检测SLC8A1-605aa与Sod2 mRNA的结合作用。放线菌素D实验检测SLC8A1-605aa对Sod2 mRNA稳定性的影响。结果利用腺病毒可在mCFs中有效介导过表达circSLC8A1_005，过表达circSLC8A1_005可显著抑制mCFs中纤维化相关基因表达，抑制mCFs的增殖和迁移能力。双萤光素酶报告基因实验结果提示circSLC8A1_005包含的2个IRES具有活性。Western blot检测结果显示circSLC8A1_005可翻译预期大小为70 ku的SLC8A1-605aa蛋白，并主要分布于细胞核内。过表达SLC8A1-605aa和circSLC8A1_005可一致地抑制mCFs的纤维化表型。SLC8A1-605aa可特异上调超氧化物歧化酶2（Sod2）表达，但并不能转录激活Sod2表达；RIP实验结果显示SLC8A1-605aa与Sod2 mRNA有特异结合作用，而放线菌素D实验结果显示SLC8A1-605aa能够增强Sod2 mRNA的稳定性。结论CircSLC8A1_005通过翻译蛋白SLC8A1-605aa发挥抑制心肌成纤维细胞纤维化表型的作用，SLC8A1-605aa可能是潜在的用于心肌纤维化治疗的靶点

狭缝引导配体1-3’非翻译区抑制心肌成纤维细胞纤维化表型的作用

目的研究狭缝引导配体1（Slit1）的3’非翻译区序列部分片段（Slit1-3’UTR）对心肌成纤维细胞的纤维化表型的调节作用和可能机制。方法利用腺病毒介导在ICR乳小鼠心肌成纤维细胞（mCFs）中过表达Slit1-3’UTR 1526nt序列（Slit1-3’UTR 1526nt），使用蛋白质免疫印迹技术评估mCFs中胶原Iα1/（COL1A1）、胶原IIIα1/（COL3A1）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）等纤维化相关基因的表达水平，结合EdU和Trans-well实验评估对mCFs增殖和迁移能力的影响。利用血管紧张素II（Ang Ⅱ）处理mCFs，检测Slit1-3’UTR 1526nt对于Ang Ⅱ处理mCFs中纤维化表型的影响。过表达Slit1-3’UTR 1526nt后转染miR-34a-5p的类似物，放线菌素D干预实验检测Slit1-3’UTR 1526nt的mRNA的稳定性。过表达Slit1-3’UTR 1526nt检测mCFs中miR-34a-5p及其靶基因SIRT1的水平。分别转染miR-34a-5p和靶向SIRT1基因的小干扰RNA（si-SIRT1），检测对Slit1-3’UTR 1526nt调控mCFs纤维化表型的影响。结果利用腺病毒可在mCFs中有效介导过表达Slit1-3’UTR 1526nt，过表达Slit1-3’UTR1526nt可显著抑制mCFs纤维化基因的表达和mCFs增殖、迁移能力，抑制Ang Ⅱ诱导mCFs的纤维化表型。放线菌素D实验结果显示转染miR-34a-5p降低mCFs中Slit1-3’UTR1526nt的稳定性，而过表达Slit1-3’UTR 1526nt时mCFs中miR-34a-5p水平降低。转染miR-34a-5p可促纤维化表型，并可逆转Slit1-3’UTR 1526nt对mCFs纤维化表型的抑制作用。在mCFs中过表达Slit1-3’UTR 1526nt显著升高miR-34a-5p靶基因SIRT1水平，在mCFs中分别转染miR-34a-5p和siRNA可一致性地逆转Slit1-3’UTR 1526nt抑制mCFs的纤维化表型。结论Slit1-3’UTR1526nt通过特异结合miR-34a-5p并增加其靶基因SIRT1表达发挥抑制mCFs纤维化表型的作用

巨噬细胞移动抑制因子诱导血管生成相关基因的表达

【目的】研究巨噬细胞移动抑制因子（MIF）对人血管内皮细胞表达血管生成相关基因的诱导作用。【方法】通过亚克隆，构建原核表达质粒pET22b-MIF，并转化人工程菌B121（DE3）。用Ni-亲合柱分离纯化BL21（DE3）中经IPTG诱导表达的重组MIF。用巨噬细胞移动抑制试验鉴定复性的重组MIF的活性。分别用0、30、60、120ng／mL的重组MIF处理人血管内皮细胞12h，通过Real-time定量PCR检测人血管内皮细胞中VEGF165、FGFR3、MMP9、TGF-α、PDGF-α的mRNA表达。用体外血管生成试验检测重组MIF诱导人血管内皮细胞的成管腔作用。[结果]正确构建了重组质粒pET22b-MIF。经IPTG诱导，在大肠杆菌中以包涵体形式表达出重组MIF。复性的重组MIF对巨噬细胞移动的抑制水平达30％（P＜0.05）。重组MIF能特异地诱导HVECs中VEGF165、FGFR3、MMP9、TGF-α、PDGF-α表达，并能特异地诱导人血管内皮细胞形成管腔结构。【结论】在大肠杆菌中成功表达出MIF，MIF能特异地诱导人血管内皮细胞中血管生成相关基因的表达

恶性疟原虫红内期p41-3 基因真核表达重组质粒的构建及序列分析

【目的】构建恶性疟原虫海南(FCC1/ HN)株p41-3 基因真核表达重组质粒pcDNA3-p41-3 ;测定p41-3 基因序列, 并了解FCC1/HN 株与其它分离株p41-3 序列的差异。【方法】根据p41-3 基因已知序列设计合成2 对引物, 用PCR 技术从 FCC1/ HN 株基因组DNA 中扩增p41-3 基因;将p41-3 基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3 , 转化大肠杆菌DH5α感受态细 胞;用酶切, PCR 扩增鉴定筛选到的重组质粒阳性克隆。以正确的重组质粒为模板, 用双脱氧链末端终止法测定p41-3 基因序 列, 应用软件辅助分析p41-3 序列及进行同源性比较。【结果】PCR 扩增得到特异的FCC1/HN 株p41-3 基因;正确的pcDNA3 -p41-3 重组质粒被筛选和鉴定。测序表明, FCC1/HN 株p41-3 基因大小为2 137 bp , 编码375 个氨基酸。恶性疟原虫 FCC1/ HN 株与FCBR 株p41-3 基因核苷酸序列同性为98 .98 %, 编码氨基酸序列同源性为99.73%。【结论】从恶性疟原虫 FCC1/ HN 株基因组DNA 中获取p41-3 基因, 成功构建真核表达重组质粒pcDNA3-p41-3, 并测定了FCC1/ HN 株p41-3 基因的序列;FCC1/HN 株与其它分离株p41-3 基因有高度的同源性

Study on crop-pan coefficient of greenhouse tomato under non-pressure irrigation

以-25 kPa作为土壤水势临界值,将作物&mdash;皿系数(Kcp)设为0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2六个处理,研究了不同灌溉水量时的番茄产量、品质和灌溉水利用效率。通过经济效益评价,研究了杨凌地区无压灌溉温室番茄获得最高经济效益时的作物&mdash;皿系数。通过张力计读数变化规律,研究了利用张力计测量无压灌溉湿润体内土壤水势的特点。研究结果表明,Kcp为0.2~0.8时,灌溉水量的增加对番茄产量影响不大;Kcp为1.0~1.2时,灌溉水量的增加能显著提高番茄产量和果实大小;Kcp为0.2时的灌溉水量能极显著提高番茄的灌溉水利用效率。在综合考虑了杨凌地区水价、番茄使用目的和市场价格波动规律后,Kcp取值1.2能获得最高的经济效益。作物&mdash;皿系数法计算灌溉水量时的滞后性特点和张力计埋设位置,是判断利用张力计监测土壤水势临界值方法有效性的两个重要因素

恶性疟原虫肝期抗原1 基因3′端的克隆及序列分析

【目的】克隆并测定恶性疟原虫海南株(FCC1/ HN)肝期抗原1 基因(LS A-1 )3′端序列, 比较FCC1/ HN 株与国 外分离株LS A-1 3′端序列的差异。【方法】应用PCR 技术从FCC1/HN 株基因组DNA 中扩增LS A-1 3′端序列, 用T-A 克隆 法将其克隆入pMD18-T 载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR 扩增鉴定后, 用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。 应用DNAS TAR 软件进行不同分离株LS A-1 3′端序列的同源性分析。【结果】PCR 扩增得到特异的FCC1/HN LS A-1 3′端序 列。酶切及PCR 鉴定获得了正确的pT-LSA-1 重组质粒。测序表明, 所克隆的LS A-1 3′端大小为795 bp , 编码264 个氨基酸。 序列分析表明, 我国恶性疟原虫FCC1/ HN 株与国外的NF54 、T9/96、KEN 、PNG 及BRA 株LS A-1 3′端编码的氨基酸序列只 在3 个位点存在不同。【结论】克隆了恶性疟原虫FCC1/ HN LS A-1 3′端片段。序列测定及同源性分析表明, FCC1/ HN LSA-1 3′端序列与其它分离株有高度的同源性

Fiber Temperature Sensor for Contact Terminal of High-voltage Circuit Breaker

针对10kV断路器在线温度监测难的问题,提出一种基于反射式强度调制的光纤温度传感器系统,温度敏感元件为双金属片.利用双金属对温度敏感的变形特性,将温度变化量调制到接收光纤输出光通量上,通过对红外接收管输出电压的检测,实现对温度的测量.通过理论推导,证实了测量系统输出电压与温度变化具有线性关系.文中详述了传感器系统的结构,给出了实验装置,进行了30~120℃内的测试实验,实验结果与理论推导吻合,且显示出较优良的特性,其测量误差小于5%,重复性良好.最后给出了在断路器触头的测温安装方法和实验结果.In order to achieve on-line temperature monitoring for the 10 kV circuit breaker,this paper proposes a type of optical fiber temperature sensor systems,which are based on the changing of reflective intensity modulation.A bimetal strip is used as the temperature sensitive element.In this system,the luminous flux of the receiving optical fiber will be changed when the bimetal deforms following temperature changes.Through detecting the voltage of the infrared receiving tube,we could achieve temperature measurements.This measurement system has been demonstrated through theoretical derivation that the output voltage has a linear relationship with the temperature change.The experimental result is in conformity with the theoretical derivation.Moreover,it indicates that this system enjoys a measurement error lower than 5% and high repeatability.福建省科技计划项目(2014H6026