High-Level Secretory Expression of Highly Pathogenic H5N1 Avian Influenza Virus HA1 Protein In Pichia pastoris and Its Study

高致病性禽流感病毒H5N1的爆发不仅给全世界养禽业造成了毁灭性打击，也严重危害到人类的生命安全，开发一种安全有效且广谱的疫苗是控制禽流感病毒传播的最有效的手段。毕赤酵母具有分子遗传操作简单、外源蛋白表达水平高、具有近似于哺乳动物细胞翻译后修饰与加工的功能，并且能进行高密度发酵。本研究利用毕赤酵母表达系统高效分泌表达了重组HA1蛋白，通过多种实验证明rHA1具有开发成H5N1禽流感广谱疫苗的可能性，在分子对接表位预测的基础上，鉴定了HA1上几个重要的中和表位的关键氨基酸，培养出了13D4-rHA1复合物晶体，为阐明H5N1病毒的保守中和抗体表位结构奠定了良好的基础。首先，将构建好的表达载体pPI...The recent outbreaks of highly pathogenic H5N1 influenza A virus not only cause a large amount of economic loss to farms but also endanger people`s life, A broad spectrum vaccine will be the most effective way to limit the spread of highly pathogenic H5N1 influenza virues. P.pastoris as a cellular host for expression of recombinant proteins is easier to genetically manipulate and culture than mam...学位：理学博士院系专业：生命科学学院生物医学科学系_生物化学与分子生物学学号：2012005140315

Evaluation of convective PCR for the detection of influenza A virus

目的评价热对流PCR应用于口岸现场甲型流感病毒快速检测的效果。方法设计热对流PCR的引物和探针,用于甲型流感病毒的检测。用甲型和乙型流感病毒毒株和入境发热人员的鼻咽拭子样本验证热对流PCR的检测灵敏度、特异性及稳定性,并与市售商品化实时荧光定量PCR试剂比较检测甲型流感病毒的效果。结果通过对8株甲型流感病毒和1株乙型流感病毒毒株进行检测,热对流PCR对H1、H3及H5亚型的甲型流感病毒毒株的检测下限为0.001~0.005HAU,具有较好的检测广谱性,且不与乙型流感病毒发生交叉反应。对155份鼻咽拭子样本进行检测,和实时荧光定量PCR相比,检测灵敏度为94.74%,特异性为97.44%,且具有很好的检测稳定性。结论热对流PCR具有很高的检测灵敏度和特异性,可用于口岸现场的甲型流感病毒快速筛查。Objective To evaluate the efficiency of convective PCR on rapid detection of influenza A virus at frontier ports. Methods The convective PCR primers and probe were designed for the detection of influenza A virus.Influenza A virus strains,influenza B virus strain and nasopharyngeal swabs of entry travelers with fever were used to analyze the sensitivity,specificity and stability of convective PCR. The detection efficiency of convective PCR was compared with commercial Real-time PCR kit. Results A broad detection spectrum of convective PCR was observed in testing 8 influenza A virus strains with different genotypes（H1、H3 and H5）and 1 influenza B virus strain,the detection limit of convective PCR for influenza A virus strain was 0.001 ~0.005 HAU. There was no cross reaction with influenza B virus. When convective PCR was applied to the detection of 155 nasopharyngeal swabs,comparison with Real-time PCR,the detection sensitivity was 94.74%,the detection specificity was 97.44%,and the detection stability was good. Conclusion Convective PCR had a high sensitivity and specificity,was fit for the rapid detection for influenza A virus at frontier ports.厦门市科技惠民计划项目（3502Z20174044）; 国家质检总局科技计划项目（2014IK045）; 福建省自然科学基金项目（2010J01152

基于颅骨及四肢骨骨折程度推测坠落高度

【目的】探索高坠所致的颅骨及四肢骨的骨折程度与坠落高度的相关性。【方法】收集2014 年6 月至2018 年 5 月发生在广州市越秀区、具有颅骨骨折和（或）四肢骨骨折且无中间障碍物及接触面为硬质平面的高坠案例共66 例。根据《人体损伤程度鉴定标准》的线性、粉碎性及开放性3 种骨折形态等级分别赋值1~3 分，并参考《简明损伤定级标准 2005》损伤区域计算最大 AIS 值（MAIS）。针对坠落高度（Y）与颅骨骨折程度（X1）、四肢骨骨折程度（X2）、年龄（X3）、性别（X4）等因素进行多重线性回归分析。【结果】年龄是骨折程度的分级与定量的影响因素。颅骨和四肢骨的骨折程度与坠落高度均具有正相关性（分别为 r1 = 0.698 和 r2 = 0.780）。坠落高度的线性回归方程：＾Y（m）= 6.660+2.843 X1+2.664 X2-0.099 X3 ，R2  = 0.871，误差为±4.577 m。【结论】研究提示颅骨和四肢骨的骨折程度是推测坠落高度的重要指标。经案例验证与高度阈值检验，回归方程具有较好的实际应用价值

红色荧光蛋白在毕赤酵母中的高效表达

报道了红色荧光蛋白(DsRFP)在毕赤酵母中的高水平表达.利用PCR技术从YEpFLAG- 1 -DsRFP扩增出DsRFP编码序列,克隆到毕赤酵母胞内表达载体pPIC3. 5K构建重组表达载体pPIC3. 5K- DsRFP,电击转化进毕赤酵母,G418 RDB平板双重筛选后获得重组转化子,经MM/MD平板培养与PCR鉴定,重组子全部为HIS+MUT+表型.重组菌株诱导表达48h后获得了高效表达,摇瓶中表达水平达到细胞内总蛋白的12%,表达量达到1. 8g/L.经硫酸铵分级沉淀,DEAE- 5PW阴离子交换柱层析与S- HyperD阳离子交换柱层析后获得电泳纯蛋白.说明我们建立的毕赤酵母表达应用平台具有高效表达外源蛋白的能力

戊型肝炎病毒ORF2片段在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定

　为了寻求新型表达系统来研制戊型肝炎病毒基因工程疫苗,利用Pichiapastoris表达系统表达戊型肝炎病毒(HEV)结构区ORF2基因.利用PCR扩增HEVORF2基因,然后将ORF2基因按正确的阅读框融合到Pichiapastoris分泌型表达载体pPIC9K的а因子信号肽编码序列3′端,重组表达载体在电击转化毕赤酵母,经过含G418的营养缺陷型培养基(RDB)筛选、重组酵母基因组总DNA进行PCR鉴定后,证实HEVORF2基因已经整合到酵母基因组中并得到重组转化子.表型鉴定后对G418具有不抗性的重组菌株诱导表达,用双抗体夹心法ELISA筛选了表达外源蛋白的重组菌株,再经SDS PAGE与Westernblot证实ORF2基因在Pichiapastoris中实现了分泌表达,而且重组蛋白具有较强的特异性与生物学活性;同时用双抗体夹心法证实在Pichiapastoris表达的上清中存在衣壳蛋白聚体

Evaluation of chemiluminescence immunoassays kits for detection of influenza A virus

目的考核甲型流感化学发光检测试剂的灵敏度和特异性。方法分别利用病毒分离培养液和入境人群的鼻咽拭子标本考查甲型流感试剂盒的检测灵敏度和特异性。结果化学发光法对H1、H3、H5、H7、H9等亚型的甲型流感病毒株均有很好的检出率,灵敏度明显优于flu A-dOT和dIrECTIgEn Ez flu A;对102份入境人群鼻咽拭子标本的检测灵敏度为97.62%。结论甲型流感化学发光检测试剂具有很好的灵敏度和特异性,适用于口岸现场的甲型流感快速筛查。Objective To evaluate the sensitivity and specificity of chemiluminescence immunoassays kit for detection of influenza A virus.Methods To analyze the sensitivity and specificity of three different assay kits for detection of influenza A virus by using the viral culture liquid and nasopharyngeal swabs from entry-exit travelers.Results The chemiluminescence immunoassays kit had a good detection rate when it was tested against a panel of influenza A virus strains(H1/H3/H5/H7/H9),and its sensitivity was much better than Flu A-DOT kit`s and Directigen EZ Flu A kit' chemiluminescence immunoassays kit used for the detection of 102 nasopharyngeal swabs from entryexit travelers had a detection sensitivity of 97.62%.Conclusion Chemiluminescence immunoassays kit had good sensitivity and specificity, which was fit for the rapid detection of influenza A virus at frontier ports.国家质检总局科技计划项目(2014IK045); 厦门市科技惠民项目(3502Z20144083

HIV-1 gp160截短蛋白在酿酒酵母中的表达

利用PCR技术从pNL-43上扩增出截短的编码gp160蛋白的基因片断,克隆到酿酒酵母表达载体YEpFLAG-1上构建表达质粒YEp-gp160Δ12,电转化到酿酒酵母中,用缺色氨酸的SC培养基筛选出阳性克隆,重组子经YP培养基诱导后进行全菌蛋白的SDS-PAGE和Western Blotting分析,筛选出高表达菌株.纯化后的重组gp160Δ12(rgp160Δ12)蛋白经ELISA鉴定显示具有良好的生物活性

重组毕赤酵母高密度发酵表达H5N1禽流感病毒糖蛋白

在10L发酵罐中,对高致病性禽流感病毒H5N1糖蛋白HA1在重组毕赤酵母中的表达发酵工艺进行了研究。通过分批补料培养方法探讨不同培养温度、诱导温度、补料方式、微量元素等因素对菌体的生长以及重组蛋白表达和活性的影响。结果表明,菌种培养和诱导温度均为25oC时,菌体的生长、分泌表达量和与广谱中和抗体的反应活性较好;微量元素是影响重组HA1蛋白生物活性的重要因素;通过优化高密度发酵工艺,H5N1病毒糖蛋白HA1在发酵罐中的表达量比摇瓶培养提高10.5倍,达到约120mg/L,为大规模制备高致病性禽流感病毒的HA1蛋白奠定了基础

重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白工程菌的高密度培养

在 10L发酵罐中对戊型肝炎病毒衣壳蛋白在重组大肠杆菌中表达发酵工艺进行了研究 ,用分批培养方法探讨了不同培养基、培养基中磷酸盐浓度和Mg2 + 浓度等因素对菌体生长与重组蛋白表达的影响 ;用分批补料培养研究了不同的补料工艺对菌体生长与重组蛋白表达的影响 ,同时对重组菌诱导时期、诱导持续时间以及不同诱导温度表达包含体在尿素溶液中的溶解性进行了研究。结果表明 ,在优化后的培养基中 ,磷酸盐浓度、Mg2 + 浓度分别为 80mmol L与 2 0mmol L时菌体生长与表达效果较好 ;分批补料培养中 ,37℃培养 9h菌体达到对数期中期 (约 4 5OD6 0 0 )为适宜诱导时期 ,加入终浓度为 1 0mmol LIPTG后诱导 5h ,OD6 0 0 达到 80以上 ,重组蛋白表达量达到2 9 74 % ,为最适收获菌体时间 ;37℃表达的包含体 80 %以上溶解在 4mol L的尿素溶液中 ,最终浓度达到 14mg mL ;10L发酵罐中确定的发酵工艺参数在 30L发酵罐中进行了放大培养 ,10L发酵罐中确定的发酵工艺参数在 30L发酵罐上具有可放大性与重复性 ,可以应用于工业生产

毕赤酵母分泌表达嵌合HEV表位的HBcAg颗粒

在毕赤酵母分泌表达嵌合有HEV受体相关表位12A10的HBcAg蛋白,经甲醇诱导后的培养液上清通过切向流浓缩、更换缓冲液后,进行疏水层析纯化.CsCl等密度梯度离心测得分泌的重组颗粒的密度为1.32 g/mL.透射电镜观察显示,纯化的重组颗粒为均一的直径30 nm左右的空心颗粒.小鼠免疫实验表明,纯化颗粒免疫8周后鼠血清中的特异性12A10抗体滴度可达到1.6×105,并且重组颗粒较好地呈递了HEV受体相关的非免疫优势表位.本文的结果为毕赤酵母胞外分泌表达其它大尺度的重组蛋白颗粒提供了参考,为研究携带表位多肽的疫苗载体提供了范例