證券財報不實之民事賠償責任-以民事舉證責任分配與減輕為中心

　　隨著我國證券市場的蓬勃興盛，投資人的理財方法，除了傳統不動產、基金等，亦有股票投資的另一可能性，然而上市公司所公布的財報倘若有不實情形，則無疑是坑殺投資大眾，且亦有對其他合法公布財報之公司不公，而有「劣幣逐良幣」之可能，是以對於「證券財報不實」之情形，我國證券交易法設有刑事及民事上之處罰，然而本文僅聚焦於投資人因「證券財報不實」所生損害賠償之民事責任，故就其相關刑事上懲罰略而不論，合先敘明。然而「證券財報不實」損害賠償之民事責任，除了要先釐清其請求權依據外，更與相關舉證責任分配習習相關，對此依實務、學說通說所採「規範說」適用下，將導致相較於上市公司弱勢之投資人，面臨主張權利存在者應負擔舉證責任之舉證困難，而與「武器平等」、「誠信原則」之概念背道而馳，對此有無適用「舉證責任減輕」之可能，至關重要。 　　因此本文會依脈絡先為請求權依據、構成要件之梳理，並琢磨於民法上因果關係與證券交易法上因果關係之異同，以釐清「責任成立因果關係」、「責任範圍因果關係」與「交易因果關係」、「損失因果關係」適用時概念之相關性；再論及「主觀可歸責性」、「交易因果關係」、「損失因果關係」與「損失數額」等舉證責任，有無「舉證責任減輕」之適用，並比較我國實務、學說間看法，必要時，亦會以我國證券交易法當初所繼受之美國相關條文、實務為借鏡，相互比較，以達說理之完整

香菇呈味特性及其濃縮物粉末化之研究

香菇具有獨特且微妙的香味，自古以來廣為中國人所喜好。因鑑於中國菜中都以香菇 為配料，且其具有特殊的醫療效果，本研究之目的在於尋求製造香菇粉末的可行方法 ，並將其製成速食香菇茶和調理兩用的調味料，以增加香菇工業的利益。 阿拉伯糖醇於冬季菇中含量較其他三季為多，且菇柄中含量較菇傘中為高；而甘露醇 與 糖分別以秋季菇、春季菇中之含量最高，且菇傘中含量較菇柄中為高。核 酸則 以鳥冀核 酸、腺核 酸、尿核 酸及胞核 酸的含量較多；且不同季節中含量亦有 差別，以冬季菇含量較高，且菇傘中含量較菇柄多。有機酸以蘋果酸的含量較高，一 般而言各種有機酸在菇傘中含量較菇柄中為多，且冬季菇的有機酸含量較其他三季稍 高。游離胺基酸以酥胺酸、麩胺酸、精胺酸、天門冬胺酸等之含量較高，且夏季菇的 胺基酸含量較其他三季為低。 乾菇傘加水５０倍、乾菇柄加水３０倍，鮮菇傘加水１０倍，分別打碎０．５、０． ５及１．５分鐘，再加熱至８０℃可得可溶性固形物含量接近於飽和，且等價鮮度最 高的香菇抽出物。 香菇抽出物的呈味成分，以三角試驗法經一系列的省略（Omission）和添加（Additi -on ）試驗得知，其主要呈味成分為酥胺酸、麩胺酸、胺基丙酸、白胺酸、異白胺酸 、組胺酸、５'' －肉核 酸、甘露醇、草酸、蘋果酸、甘醇酸等１２種。 香菇濃縮物加入等量的糊精或化工澱粉後，經入口溫１５０℃出口溫８０℃的噴霧乾 燥後所製成的香菇粉末，其中以麥芽糊精所製成的粉末有最末的性質與擔體有密切關 係。 速食香菇調味料的最佳配方，為香菇粉末１００克、食鹽８５克、解植物性蛋白４克 、味精１克、香菇小片１克及核 酸１克，其品評結果均較市佶香菇調味料好

DNA Oxidative Damage Induced by Cooking Oil Fumes in Human Lung Adenocarcinoma CL-3 Cells and Protection Mechanisms of Quercetin

本研究主要以人類肺腺癌CL-3細胞為研究模式，探討煎魚油煙誘發之DNA傷害，並探討天然抗氧化物 - 槲皮酮之保護分子機轉。首先為了解煎魚油煙是否造成DNA傷害，並確定此DNA傷害以氧化性傷害或是以多環芳香烴 (polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)類DNA傷害為主，將人類肺腺癌CL-3細胞分別以不同濃度的煎魚油煙和相當量的BaP (benzo[a]pyrene)處理，結果發現煎魚油煙造成的慧尾長度較BaP為長，顯示煎魚油煙能使肺癌細胞產生較多的DNA單股斷裂。由此推測煎魚油煙中含有非BaP的成分所造成的DNA傷害。 為了解煎魚油煙誘發的DNA傷害除了bulky DNA 傷害之外，是否還有氧化性DNA傷害，而以各種活性氧捕捉劑與煎魚油煙同時處理人類肺腺癌CL-3細胞，並以流式細胞儀分析細胞內過氧化物生成量之變化，結果顯示活性氧捕捉劑能減少煎魚油煙誘發的DNA單股斷裂，並且煎魚油煙亦能增加胞內過氧化物的生成量，顯示煎魚油煙確能誘發人類肺腺癌CL-3細胞產生活性氧，而造成氧化性DNA傷害。已知活性氧能透過增強轉錄因子-kB (nuclear factor-kappa B, NF-kB) 與DNA鍵結能力，而活化NF-kB轉移至細胞核內以調控下游基因表現。因此推測煎魚油煙亦能活化NF-kB而誘發環氧合酶-2 (cyclooxyhenase-2, COX-2) 基因的表現。以不同濃度的煎魚油煙處理CL-3細胞，結果呈現濃度線性地增強NF-kB與DNA鍵結能力、細胞色素 P-450 1A1 (cytochrome P-450 1A1, CYP 1A1) mRNA以及COX-2 蛋白的表現。0-500 g/ml煎魚油煙和相當量的BaP比較下，煎魚油煙引起之COX-2蛋白的表現顯著較BaP為高。當各種活性氧捕捉劑與煎魚油煙同時處理人類肺腺癌CL-3細胞時，四種活性氧捕捉劑對於煎魚油煙誘發的COX-2蛋白的表現量具有不同程度抑制效果，其中又以超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD) 和甘露糖醇 (mannitol) 之抑制效果較強，顯示參與煎魚油煙誘發COX-2蛋白表現的活性氧可能主要是超氧陰離子和羥自由基。 除此之外，煎魚油煙誘發的COX-2蛋白表現與丙二醛 (malondialdehyde; MDA)生成量及前列腺素(prostaglandin E2, PGE2)分泌量成正相關性，其相關係數分別為r2= 0.816 及r2= 0.804，顯示參與煎魚油煙誘發COX-2蛋白表現、MDA及8-OH-dG的形成以超氧陰離子和羥自由基較重要。綜合得知，煎魚油煙會促使CL-3細胞產生活性氧而造成氧化緊迫，並誘發NF-kB訊號路徑，而促使COX-2表現，因而產生PGE2而可能造成免疫微環境 (immune microenvironment) 的改變。因此油煙暴露不僅會造成bulky DNA以及氧化性DNA傷害，而引起染色體不穩定 (chromosome instability)。同時也引起免疫反應失常，這或許與經常暴露烹調油煙之台灣女性肺癌的形成有關。 為探討槲皮酮是否能減少煎魚油煙誘發的DNA氧化性傷害，以彗星分析法得知，1- 25 M槲皮酮與100 g/ml煎魚油煙同時處理人類肺腺癌CL-3細胞時，槲皮酮可呈現劑量反應的抑制煎魚油煙增強的慧尾長度，且槲皮酮之保護效果顯著高過於其他的特異性抑制劑，包括活性氧捕捉劑-NaN3、CYP1A1特異性抑制劑-NF 和COX-2特異性抑制劑-NS398，其IC50分別為5.2 M 、175.9 M、9.9 M和 13.5M。已知CYP 1A1和COX-2參與煎魚油煙誘發的DNA傷害，因此再以RT-PCR和西方墨點分析法 (Western Blot) 分析槲皮酮對煎魚油煙誘發的CYP 1A1 mRNA及COX-2蛋白表現之影響，結果發現，1- 25 M槲皮酮顯著地抑制煎魚油煙誘發的CYP 1A1 mRNA及COX-2蛋白表現，且呈劑量反應關係。 煎魚油煙產生活性氧能增強NF-kB與DNA之鍵結能力。為探討槲皮酮是否會經由多環芳香烴感受器路徑及NF-kB活化作用而調控煎魚油煙誘發的CYP1A1和COX-2的基因表現，由凝膠遲滯分析(gel retardation assay)的結果獲知，槲皮酮不但有效抑制煎魚油煙誘發的AhR-Arnt複合體與DRE的鍵結作用，也減少NF-kB與DNA鍵結能力，因而達到抑制CYP1A1和COX-2基因的表現，進而減少DNA傷害。以上結果顯示，槲皮酮有效減少NF-kB 及AhR:Arnt/ DRE之DNA鍵結能力，進而抑制CYP1A1和COX-2基因的表現，是促使槲皮酮對煎魚油煙所造成之DNA傷害的保護效果顯著高於NF、 NS398等特異性抑制劑或活性氧捕捉劑-NaN3的原因。這結果顯示槲皮酮或許能化學預防油煙引起之台灣女性肺癌之危險性。The aim of this study is to investigate the DNA damage induced by cooking oil fumes (COF) and the possible protection mechanisms of natural antioxidant-quercetin in human lung adenocarcinoma CL-3 cells. By comet assay, it was shown that crude COF, compared to pure benzo(a)pyrene (BaP) with a quantitative equal amount in such crude COF, posses a more potent capability of single strand breakage in CL-3 cells. To verify whether reactive oxygen species (ROS) was generated in COF-treated CL-3 cells to contribute to the oxidative DNA damage, fluorescence assay was used to determine the intracellular ROS generation of COF. The results showed a linear-dose response of intracellular peroxides formation induced by COF ranged from 0 to 200 μg/ml and strongly suggested that intracellular ROS were indeed generated by COF in CL-3 cells. To explore further, four ROS scavengers, including sodium azide (NaN3), mannitol, superoxide dismutase (SOD) and catalase, were added simultaneously with COF to CL-3 cells. Our data showed that the DNA damage induced by COF was significantly inhibited by these four scavengers. ROS has been shown to involve in the induction of cyclooxygenase-2 (COX-2), therefore, the effect of these four scavengers in the COX-2 protein expression induced by COF was also evaluated by western blot. The result showed that mannitol and SOD were stronger inhibitors for COX-2 protein expression than the other two scavengers. In addition, COX-2 protein expression levels were correlated with the amounts of prostaglandin E2(PGE2) (r2= 0.804) and malondialdehyde (MDA)( r2= 0.816). These results appear to reveal that hydroxyl radical and superoxide anion may be more important in induction of COX-2 and the formation of MDA and 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OH-dG) in CL-3 cells treated by COF. In conclusion, COF may contribute to ROS-induced oxidative stress and also the alteration of immune microenvironment mediated by PGE2 production through COX-2 induction. We thus suspect that COF-induced oxidative stress may play a more important role than bulky DNA damage in lung cancer development among Taiwanese women nonsmokers. We suspect that quercetin may be a potent inhibitor for reduction of COF-induced DNA damage, and prevention of lung cancer development. In this study, comet assay was used to evaluate the DNA damage induced by a relatively low dose of COF (100 μg/ml) in human lung adenocarcinoma CL-3 cells. To understand whether quercetin has the most potent protective effect on COF-induced DNA damage, the IC50 value of COF-induced DNA damage of quercetin was compared with those of αNF, NS-398, and NaN3, which are specific inhibitors, or scavenger of CYP1A1, COX-2, and ROS, respectively. The IC50 value of quercetin was only one half, one third and one thirty fifth of that of αNF, NS-398 and NaN3, respectively. Clearly, quercetin was the most effective inhibitor of COF-induced DNA damage followed sequentially by αNF, NS-398, and NaN3. To further elucidate whether COF-induced DNA damage inhibition of quercetin is mediated through the inhibition of COX-2 gene expression by altering NF-kB pathway, COX-2 mRNA and its protein expressions induced by COF were evaluated by RT-PCR and western blot, respectively. Our data showed that COX-2 mRNA and protein levels were significantly repressed by the addition of quercetin in a dose dependent manner. Moreover, the gel retardation assay showed that NF-kB DNA binding activity induced by COF was significantly inhibited by quercetin. From our previous and present studies, it is revealed that co-expression of COX-2 and CYP1A1 caused by COF may contribute to genomic instability in lung cancer development. Thus, quercetin may act as a potent chemopreventive agent of lung cancer for nonsmoking Taiwanese women.壹、中文摘要 貳、緒 言 叁、文獻綜論 一、油煙暴露與女性肺癌 1 (一)、肺癌的流行病學及其危險因子 1 (二)、台灣女性肺癌之流行病學 4 (三)、烹調油煙(COF)與女性肺癌之相關性 7 1、COF的來源及其化學成分 7 2、COF之生物毒性、基因毒性與致癌性 11 3、COF成分與女性肺癌的關係 13 4、COF造成之DNA傷害 14 二、活性氧與氧化性傷害 17 (ㄧ)、氧化性傷害之種類 17 (二)、油脂過氧化作用 21 (三)、活性氧和自由基與癌症形成之相關性 23 (四)、抗氧化物之抗致癌機制 25 三、槲皮酮之化學預防性 27 (一)、槲皮酮之生理活性 27 1、槲皮酮的抗氧化活性 27 2、槲皮酮的抗癌功效 29 3、其他生理活性 31 (二)、槲皮酮與細胞色素P450 1A1 31 (三)、槲皮酮與環氧合酶 33 (四)、槲皮酮與肺癌 34 肆、材料與方法 39 一、化學藥品與材料 39 二、COF的製備與萃取 40 三、樣品之純化 40 四、臺灣肺腺癌CL-3細胞之培養 41 五、細胞解凍與保存 41 六、DNA的萃取與純化 42 七、RNA的萃取與純化 42 八、DNA傷害分析 43 (一)、DNA電泳分析 43 (二)、慧星分析(comet assay): 單細胞電泳分析 44 (三)、8- OH-deoxyguanosine含量之分析 45 (四)、BPDE-DNA鍵結物含量之分析 45 九、流式細胞分析法測定細胞內氧化傷害之程度 46 十、反轉錄聚合酶鏈反應 47 十一、西方墨點分析法(Western Blot) 48 十二、Gel Retardation assay 50 十三、丙二醛含量之分析 51 十四、細胞毒性之分析 52 十五、前列腺素E2含量之分析 53 十六、統計分析 53 伍、結 果 54 一、COF引起之氧化緊迫與基因毒性 54 (一)、COF造成體外DNA股斷裂傷害之分析 54 (二)、COF造成人類肺腺癌CL-3細胞DNA股 斷裂之分析 56 (三)、COF造成CL-3細胞胞內氧化壓力之分析 58 (四)、COF造成CL-3細胞DNA氧化傷害種類之分析 59 (五)、COF造成CL-3細胞產生BPDE-DNA鍵結 物含量之分析 60 (六)、COF誘發CL-3細胞CYP 1A1 mRNA之表現 60 (七)、COF誘發CL-3細胞COX-2 mRNA之表現 61 (八)、COF誘發CL-3細胞COX-2蛋白之表現 61 (九)、COF誘發COX-2蛋白表現之分子機制 64 (十)、COF誘發COX-2蛋白與發炎性之相關性 65 (十一)、COF與免疫反應基因之相關性 66 (十二)、COF與DNA修補基因之相關性 67 二、槲皮酮抑制COF造成DNA傷害之分子機轉 69 (一)、槲皮酮對COF引起DNA傷害之保護效果 69 1、 槲皮酮對COF引起DNA股斷裂傷害之影響 69 2、 槲皮酮對COF引起CL-3細胞DNA股斷裂 傷害之保護效果 69 3、 槲皮酮對COF引起CL-3細胞胞內氧化傷害 之影響 71 4、 槲皮酮對COF主要成分-BaP造成CL-3細胞產生 BPDE-DNA鍵結物含量之影響 72 (二)、槲皮酮減少COF造成CL-3細胞DNA傷害之 分子機制 73 1、 槲皮酮對COF誘發CL-3細胞CYP1A1 mRNA 表現之抑制效果 73 2、 槲皮酮抑制COF誘發CL-3細胞CYP1A1 mRNA 表現之分子機制 74 3、 槲皮酮對COF誘發CL-3細胞COX-2 mRNA表現 之抑制效果 75 4、 槲皮酮對COF誘發CL-3細胞COX-2 蛋白表現 之抑制效果 76 5、 槲皮酮抑制COF誘發COX-2表現之分子機制 76 6、 槲皮酮對COF抑制DNA傷害修補基因之影響 77 7、 槲皮酮對COF誘發IL-6基因表現之影響 78 陸、討 論 79 一、 COF誘發氧化緊迫及基因毒性之分子機轉 79 二、 槲皮酮抑制COF造成DNA傷害之分子機轉 85 (一)、槲皮酮對CYP1A1基因層次之調控及AhR 路徑 85 (二)、槲皮酮對COX-2基因層次之調控及NF-kB 路徑 87 (三)、槲皮酮對肺癌之化學預防 89 柒、結 論 捌、參考文獻 玖、附錄 15