乌鳢免疫球蛋白M重链和免疫球蛋白轻链的克隆与特征分析

应用RACE-PCR方法克隆并鉴定了乌鳢免疫球蛋白M(i mmunoglobulin M,Ig M)重链(H)和免疫球蛋白轻链(L)全长cDNA。乌鳢IgH cDNA全长1 912个核苷酸(nt),包含1 797 nt的开放阅读框,编码598个氨基酸(aa)。IgH恒定区(CH)均包含1对保守的半胱氨酸残基形成链内二硫键,其中CH1区氨基末端存在保守的半胱氨酸残基与轻链形成链间二硫键,4个推测的N-糖基化位点(NXT和NXS)则分别位于CH1、CH2和CH4。序列比对发现乌鳢IgHCH1与CH2交界处氨

Molecular cloning, identification and characterization of immune-relevant genes in snakehead Channa argus

鱼类具备两种基本的免疫应答类型：先天性免疫应答和适应性免疫应答。头肾主要由网状内皮系统支持下的淋巴造血组织构成，包括淋巴细胞、单核细胞、浆细胞、两种或三种的粒细胞以及巨噬细胞等，担负着机体特异性和非特异性免疫反应，在个体发育过程中可能为免疫系统的生发中心。为了解乌鳢在病原刺激后的免疫反应，以及为鱼类分子免疫学研究提供一定的科学依据，本研究以poly I:C体内诱导乌鳢为测试组，对照鱼为驱动组，通过抑制差减杂交构建富含诱导后差异表达基因的乌鳢头肾差减cDNA文库。利用PCR和斑点杂交筛选文库，揭示了一批与哺乳类IFN系统基因同源，参与干扰素信号转导和转录调控的相关基因，如信号转导和转录激活因子（STAT）、干扰素调控因子（IRF），IFN刺激基因（IFN stimulated gene, ISG）或抗病毒基因，如Viperin、ISG15和ISG12，以及其他的免疫相关基因包括鼠李糖凝集素（RBL）、组织相容性抗原复合物（MHC I）、免疫球蛋白重链和轻链（IgM和IgL）、热休克蛋白70（HSP70），受体激活蛋白C（RACK）等。 通过RACE扩增的方法获得乌鳢STAT1、IRF1、Viperin、ISG15 cDNA全长。在此基础上，根据乌鳢IRF1以及已知IRF2和IRF7同源分子，设计位于开放阅读框保守位置的IRF2和IRF7兼并引物，扩增IRF2和IRF7片段。进而完成了三个干扰素调控因子cDNA和基因组克隆。分析三种鱼类干扰素调控因子的基因结构，并与人类IRF1、IRF2和IRF7基因进行了比较基因组学研究，发现IRF1和IRF2基因在进化上具有高度的保守性，外显子和内含子的组织模式在乌鳢和人基本一致，并且IRF1和IRF2基因之间也存在进化的保守性，尤其DNA结合区的外显子区段；乌鳢IRF7 5′ 端非编码区未出现内含子，这使该基因的组织模式与人IRF7显著不同。同时检测了三种IRF的组织分布，并且证实这些基因在脾脏和肝脏中能够被poly I:C诱导表达。为了解干扰素调控因子表达的分子基础，通过基因步移的方法，获得乌鳢三个干扰素调控因子的启动子序列。分析乌鳢干扰素调控因子启动子区的目的是寻找可能的转录因子结合位点，了解IRFs的表达调控，以及干扰素调控因子能够被病毒和双链RNA诱导表达的分子机理。此外，通过基因步移的方法，我们还获得了STAT1、Viperin和ISG15的启动子序列，鉴定了两种干扰素刺激基因，并比较了这两种干扰素刺激基因的启动子区特征。我们发现在Viperin和ISG15启动子区存在保守的干扰素刺激反应元件（ISRE）和γ-干扰素激活序列（GAS）。此外，Viperin启动子区包含保守的NF-κB结合位点，这是保守的NF-κB结合位点以一致的序列模式（GGGRNNYYCC）出现在鱼类干扰素刺激基因启动子区的首次报道。通过分析乌鳢STAT1和IRF7启动子序列特征，表明鱼类存在类似哺乳动物信号反馈的传导通路调控细胞对干扰素信号的反应。这为研究干扰素系统基因的调控奠定了基础。在此基础上，我们讨论了干扰素调控因子在调控免疫相关基因和病毒或干扰素介导的信号传导通路中潜在的角色。从低等脊椎动物到高等脊椎动物，鱼类和哺乳类干扰素和抗病毒蛋白呈现不同水平的差异，这从一定程度上反映了它们在不同生境中遭遇不同病原的选择压力。然而，根据我们的结果来看，不仅干扰素信号通路成员是保守的，而且干扰素调控因子和干扰素刺激基因的调控方式均与哺乳动物类似。此外，用RACE-PCR扩增的方法克隆到MHC I类分子，免疫球蛋白重链和轻链，RBL等全长cDNA序列。通过基因步移的方法获得RBL基因全长及其启动子序列。检测了STAT1、Viperin、ISG15、MHC I和RBL基因在各组织中的表达情况，同时还检测了poly I:C诱导后Viperin和ISG15在肝脏中的诱导表达。 在差减杂交和同源PCR的基础上，通过RACE和基因步移，我们克隆并鉴定了STAT1、IRF1、IRF2、IRF7、Viperin、ISG15，以及其他免疫相关基因。着重对干扰素系统几个基因的结构特征、表达特性、诱导机制、分子进化等进行了比较研究，初步揭示出鱼类存在复杂的调控网络介导IFN系统基因的表达。乌鳢免疫相关基因的研究工作对了解鱼类免疫机制以及鱼类抗病药物的开发具有重要的理论指导意义

中华鳖造血和免疫器官的个体发育

采用常规孵化的中华鳖胚胎为材料，对不同发育时期造血和免疫器官进行了组织学研究，描述了卵黄囊、胸腺、肝、脾、肾以及骨髓的形态结构变化。发现胚胎期首先出现的造血器官是卵黄囊。此后，卵黄囊的造血干细胞出现在胚体的血循环中，造血功能相继在胚胎胸腺、肝、脾、骨髓(可能还包括肾)中产生。胸腺是中华鳖免疫系统发育的第一个淋巴器官，来自卵黄囊的干细胞在此先分化成小淋巴细胞，然后再迁移至脾脏。脾脏发育中首先出现各发育阶段的红细胞、嗜酸性的细胞和少量粒细胞，淋巴细胞出现较晚，未发现淋巴小结。在胚胎期肝脏发育过程中可见不同发育时期的红细胞和嗜酸性的细胞。在肾的发育过程中，尚可观察到嗜酸性的细胞和类似头肾组织的细胞团。直至出壳前，骨髓内方可见各发育阶段的各系细胞动物学报49(2)：238—247，2003

中华鳖造血和免疫器官的个体发育

采用常规孵化的中华鳖胚胎为材料 ,对不同发育时期造血和免疫器官进行了组织学研究 ,描述了卵黄囊、胸腺、肝、脾、肾以及骨髓的形态结构变化。发现胚胎期首先出现的造血器官是卵黄囊。此后 ,卵黄囊的造血干细胞出现在胚体的血循环中 ,造血功能相继在胚胎胸腺、肝、脾、骨髓 (可能还包括肾 )中产生。胸腺是中华鳖免疫系统发育的第一个淋巴器官 ,来自卵黄囊的干细胞在此先分化成小淋巴细胞 ,然后再迁移至脾脏。脾脏发育中首先出现各发育阶段的红细胞、嗜酸性的细胞和少量粒细胞 ,淋巴细胞出现较晚 ,未发现淋巴小结。在胚胎期肝脏

乌鳢(Channa argus)干扰素刺激基因Viperin和ISG15及其启动子的克隆与特征分析

应用抑制差减杂交、末端快速扩增和基因步移技术,克隆并鉴定了乌鳢干扰素刺激基因Viperin和ISG15及其启动子序列.Viperin cDNA全长1474nt,包含1059nt的开放阅读框,编码352个氨基酸.除N末端70个氨基酸外,Viperin蛋白氨基酸序列在鱼类和哺乳类具有高度的保守性.ISG15 cDNA全长758nt,包含468nt的开放阅读框,编码155个氨基酸,含有两个泛素样(UBL)结构域,C末端具有保守的UB偶联结构(LRGG).Viperin和ISG15启动子区存在保守的干扰素刺激反

线粒体未折叠蛋白反应对Aβ蛋白聚集毒性的影响

【目的】探讨线粒体未折叠蛋白反应（UPR mt ）对阿尔茨海默病（AD）Aβ蛋白聚集毒性的影响。【方法】将秀丽线 虫（Caenorhabditis elegans）线粒体外膜tomm-22、内膜E04A4.5以及atfs-1基因克隆并构建L4440干扰载体，转化HT115感受 态细胞以制备 tomm-22、E04A4.5 和 atfs-1 RNA 干扰菌。研究 tomm-22 和 E04A4.5 RNA 干扰对转基因线虫 AD 疾病模型 CL4176和CL2006瘫痪进程的影响。观察tomm-22和E04A4.5 RNA干扰后野生型线虫N2寿命，检测ATFS-1信号在抑制Aβ 蛋白聚集毒性中的作用，分析tomm-22和E04A4.5 RNA干扰后转基因线虫SJ4100 UPR mt 动态变化，以及转基因线虫DA2123 自噬水平。【结果】通过对线虫线粒体tomm-22和E04A4.5基因克隆及构建RNA干扰菌建立了UPR mt 模型，证实能够抑制AD 疾病模型CL4176 Aβ蛋白聚集毒性并延缓其瘫痪进程。野生型N2在喂食tomm-22和E04A4.5 RNA 干扰菌后寿命明显缩 短，而渐进性瘫痪线虫AD模型CL2006呈现前期延缓瘫痪而后期加速瘫痪的生理现象，说明UPR mt 呈现短期缓解线粒体应 激和改善线粒体功能的调节作用。通过atfs-1 RNA干扰证实延缓线虫AD模型CL4176瘫痪进程与ATFS-1信号不直接相 关。然而，tomm-22和E04A4.5 RNA干扰后UPR mt 呈现逐渐增强的趋势，并进一步诱导自噬相关分子LGG-l的上调表达，提 示RNA干扰延缓AD瘫痪进程是通过提高线虫体内自噬活性而发挥作用。【结论】线粒体UPR mt 通过协调线粒体与细胞核之 间的信号转导能够抑制Aβ蛋白聚集毒性，有助于恢复线粒体乃至细胞内蛋白质稳态，保障细胞正常生理功能，为AD等神 经退行性疾病的早期预防和治疗提供新的靶点

转生长激素基因促进鲤鱼胸腺的发育

采用显微注射方法，获得转“全鱼”生长激素(GH)基因鲤鱼(转基因鱼)，并对其胸腺发育进行观察．1龄F1转基因鱼胸腺显著增大、重量增加．单侧胸腺最大重量达295mg，最小为190mg，平均为218．6mg；而对照鱼胸腺最大重量仅为81mg，最小只有20mg，平均为42．5mg．转基因鱼与对照鱼胸腺绝对重量之比为5．14：1，胸腺重量指数之比为2．97：1．显微观察表明，转基因鱼胸腺高度发达，外区明显增厚，胸腺细胞高度密集；而对照鱼胸腺出现退化，外区较薄，淋巴细胞分布较为稀疏，可见明显的脂肪细胞团．电子显微镜进一步观察显示，转基因鱼增生的细胞主要为小淋巴细胞，未发现结构上的异型性变化．上述观察证明，转“全鱼”GH基因明显促进鲤鱼胸腺继续发育、胸腺细胞增生和有效延缓、防止胸腺退化．实验结果为进一步研究转GH基因鱼的免疫生物学效应奠定了基础

养殖乌鳢类立克次体感染的超微病理学研究

应用电子显微镜技术,观察了养殖乌鳢RLO感染主要内脏器官超微结构病理变化,并初步探讨了发病机制。观察发现:RLO寄生细胞明显肿大,胞质电子密度低,细胞器肿大、溶解,RLO可随肿胀、破裂的细胞进入组织间隙;在一些寄生细胞内尚发现变性的RLO。内脏组织细胞普遍肿大,细胞器分散、稀少,线粒体除明显肿胀、嵴断裂消失外,尚发现坏死性变化即出现致密核心或无定形的电子密度物质;粗面内质网扩张、破裂和脱颗粒;部分细胞内溶酶体增多,胞质内发现明显的髓鞘样结构;核肿大或核固缩、溶解,并可见核内出现髓鞘样结构和核包含物