Physicochemical regulation of CALHM1 channel and electrical gap junction formation

학위논문(박사) -- 서울대학교대학원 : 의과대학 의과학과, 2024. 2. 김성준.Calcium homeostasis modulator 1 (CALHM1)은 pore가 매우 큰 (∼14 Å) 이온통로로 Ca2+, Na+, K+, Cl− 뿐만 아니라 ATP4−를 통과시킨다고 보고되었다. 전압의존적으로 활성화되지만, 강한 탈분극 조건에서도 매우 느리기 활성화될 뿐이어서 생리적 역할에 대한 의문이 있다. 최근에는 cryo-electron microscopy (cryo-EM)을 통해 CALHM1, 2, 4의 간극연접 (gap junction) 구조가 밝혀졌다. 이런 배경에서, CALHM1의 전압의존적 활성화가 강화될 수 있는 물리화학적 조건 (온도, pH, 산화-환원)과 CALHM1의 분자구조적 관련성을 연구하였다. 또한 실제로 CALHM1과 CALHM2가 전기적 간극연접을 형성할 수 있는지 알아보았다. Calhm1 (mouse CALHM1)은 온도가 올라갈수록 전류 크기가 매우 민감하게 증가할 뿐만 아니라 (Q10 > 10) 전압의존도가 더 민감해졌고 (V1/2의 좌방이동), 활성 속도 또한 빨라졌다. 온도 감지 부위로 C-term helix (CTH)를 예상하였으나, CTH를 순차적으로 짧게 만들어도 온도감수성은 여전하였으며, 모든 CTH를 잘랐을 시에는 기능 소실이 나타나서 온도 감지 여부를 알 수 없었다. 세포 내·외 pH에 의한 CALHM1의 활성 변화를 각각 분석하기 위해, 피펫 또는 세포외 용액을 pH 6.2부터 8.6까지 변화시키면서 팻취클램프 실험을 하였다. 세포 안과 밖의 pH가 낮을수록 (pH 6.8, 6.2), 전류 크기가 감소할 뿐만 아니라 더 높은 막전압에서 활성화되었다. 반면, pH가 높을수록 (pH 8.0, 8.6) 전류 크기는 증가하였고, 더 낮은 막전압에서 활성화되었다. pH를 감지하는 부위를 확인하기 위해 분자구조를 토대로 예측한 주요 극성 아미노산 잔기들을 점변이 시키고 pH 반응을 관찰하였다. 세포 안쪽 및 안쪽 구멍에 가까운 5개 아미노산 (E17, K229, E233, D257, E259)의 각 점변이에서 알칼리 pH로 인한 전류 증가가 훨씬 덜 일어나는 것을 확인하였다. 반면, 산성 pH의 억제효과와 pH에 따른 전압의존도 변화는 정상과 비교해 차이가 없었다. 산성 pH로 인한 전류 감소는 세포외 영역의 CALHM1 잔기들 변이에서도 여전히 나타나서, 산성 pH 감지 잔기를 특정할 수 없었다. 하지만 세포외 산성 pH 조건에서는 세포외 칼슘을 낮췄을 때 일어나던 CALHM1 전류 증가가 일어나지 않았다. 이는 세포 밖 칼슘과 수소 이온의 억제 작용이 미지의 특정 잔기들에 대한 공통 작용으로 일어날 수 있음을 시사한다. CALHM1 이온통로는 8개의 monomer로 구성되며, 하나의 monomer에는 4개의 막관통 도메인 (transmembrane domain)과 두 쌍의 이황화결합 (disulfide bond)이 있다. 이황화결합을 형성하는 4개의 시스테인의 돌연변이에서 세포막 발현과 다량체 형성이 되지 않음을 관찰하였다. 또한, 정상적으로 형성된 이후 산화·반응에 의해 결합이 끊어지게되면 세포막 발현과 전류가 감소하는 것을 관찰하였다. 따라서 이황화결합은 CALHM1의 형성과 기능 유지에 필수적인 구조이며, 산화 환경에 장기 노출 시 이온통로 기능 장애가 일어날 수 있음을 시사한다. CALHM1의 ATP 분비 기능을 확인하기 위해 luciferin-luciferase 반응을 이용하여 ATP 농도를 측정하였다. CALHM1이 과발현된 세포에서만 세포 밖 칼슘 농도의 감소 (0 mM)에 의해 ATP 분비가 증가하였고, 이는 CALHM 억제제인 ruthenium red (RuR)에 의해 감소되었다. 이는 CALHM1 이온통로를 통해 ATP 분비가 일어남을 의미한다. CALHM family (CALHM1-6)는 다른 large-pore 통로들 (connexin, innexin, pannexin, LRRC8)과 구조와 기능이 유사하며, 이들처럼 간극연접 (gap junction)을 형성할 수도 있을 것이라 생각되었다. Human CALHM2, C. elegans CALHM1, human CALHM4에 대한 최근의 분자구조 연구들은 간극연접 형성 가능성을 시사한다. CALHM1과 CALHM2, 그리고 Connexin 43의 상시 과발현 세포주를 대상으로 two-electrode 팻취클램프 실험을 수행하였다. 대표적인 간극연접 통로인 Connexin 43과 유사하게 human CALHM1, CALHM2에서 대칭적인 양상의 간극연접 전류가 관찰되었다. 또한, 두 세포의 전압차 (transjunctional voltage,Vj)가 80 mV 이상일 때, 빠른 inactivation이 공통적으로 관찰되었다. 전도-전압 관계 곡선 (G-V curve)이 종 모양 (bell-shape)으로 보이는 것도 세 가지 통로들에서 유사하게 관찰되어서, 실제로 CALHM1과 CALHM2는 hemichannel로서 작동할 수도 있지만, 세포간 연접부위에서 연결되면 전기적 간극연접통로를 형성함을 발견하였다. 종합해보면, CALHM1은 막전압과 세포 밖 칼슘 농도 뿐만 아니라, 온도와 pH에 의해 조절되는 이온통로임을 규명하였다. 또한 hemichannel에서 ATP를 분비하는 기능에 더하여 CALHM1, CALHM2가 실제 세포에서 간극연접을 형성하는 것을 확인하였다. 이는 CALHM 이온통로의 새로운 생리적 역할을 규명하는데 기초가 될 것으로 기대된다.Calcium homeostasis modulator 1 (CALHM1) is the most recently identified ion channel protein having nonselective ionic permeability to large ions including ATP4− and slow kinetics of activation under strong membrane depolarization. In addition, cryo-electron microscopy (cryo-EM) suggested plausible formation of gap junction structure in CALHM1, 2 and 4. In this study, I investigated the sensitivity of CALHM1 to temperature and pH. Also, I studied the role of intramolecular disulfide bonds in the biogenesis and activity of CALHM1. Finally, the formation of electrical gap junctions was elucidated in CALHM1 and CALHM2. As the temperature increased, not only the Calhm1 (mouse paralogue of CALHM1) current amplitude but also the activation speed was dramatically increased. The voltage- dependence of Calhm1 was shifted to the leftward direction by raising the temperature. To analyze the pH sensitivity of CALHM1, pH of either bath (pHe) or pipette (pHi) solution was chaged from 6.2 to 8.6. The voltage-dependence of CALHM1 activa- tion was greatly facilitated by alkaline pHi as well as pHe, and conversely suppressed by acidic pHe and pHi. To identify the specific amino acides responsible for the pH- sensitivity, the titralbe residues predictively exposed to the water accessible pore and upper/lower cavities were point-mutated. Mutations in 5 amino acids located inside the cell and in the pore (E17, K229, E233, D257, E259) lead to the reduced facilitation by alkaline pHi and pHe. The acidic pH-sensing site could not be identified despite the extensive mutations of the candidate residues. Nevertheless, a non-competitive in- hibition by acidic pHe despite the lowered extracellular Ca2+ suggested a common inhibitory mechanism between H+ and Ca2+. CALHM1 protein contains four transmembrane domains and two pairs of disulfide bonds. Any of the mutations in the four Cys resulted in non-functional channels or fail- ure of membrane expression. Furthermore, breaking the disulfide bonds in wild-type CALHM1 by using oxidizing agents slowly decreased the plasma membrane expres- sion as well as the current amplitude, indicating the essential structural role of disulfide bonds in the formation and function of CALHM1. The ATP permeability of CALHM1 was analyzed using the luciferin-luciferase reaction. ATP secretion increased in the cells overexpressing CALHM1 in response to the removal of extracellular Ca2+, which was abolished by ruthenium red, an in- hibitor of CALHM family channels. Despite the results demonstrating the functional properties of CALHM1 as the conventional ion channels, recent cryo-EM studies in CALHM family proteins suggested plausible formation of gap junction-like structure. Using two-electrode voltage-clamp technique, the genuine electrical gap junction cur- rent could be confirmed in CALHM1 and CALHM2 over-expressing HeLa cells, as well as the classical Connexin 43 over-expressing cells; symmetrical junctional cur- rents with rapid inactivation was observed at the transjunctional voltages larger than 80 mV, resulting the characteristic bell-shape voltage dependence of the gap junctions. In summary, CALHM1 has been identified as an ion channel regulated by mem- brane voltage, extracellular calcium concentration, temperature, and pH. In addition to the function of secreting ATP from hemichannels, CALHM1 and CALHM2 could also for the electrical gap junctions, laying the foundation for understanding the new physiological roles of CALHM ion channels.국문초록 i 제 1장 서 론 7 1.1 CALHM1 이온통로의 특성 7 1.2 CALHM 이온통로의 구조 9 1.3 이온통로의 온도 및 pH 영향 13 제 2장 연구목표 15 제 3장 연구방법 16 3.1 전기생리 16 3.1.1 실험 용액의 조성 17 3.1.2 시약 및 재료 18 3.1.3 실험 결과의 분석 방법 19 3.1.4 간극연접 전류의 측정 20 3.2 세포막 비오틴화 및 면역블로팅법 21 3.3 면역침강법 22 3.4 공초점 이미징 23 3.5 분자 구조 모델링 23 3.6 Luciferin-Luciferase assay 24 3.7 실험 결과의 통계 24 제 4장 실험결과 25 4.1 Calhm1 이온통로의 온도 의존성 25 4.1.1 온도와 Calhm1의 전류 25 4.1.2 온도와 Calhm1의 활성 속도 27 4.1.3 세포 밖 칼슘 농도, 온도 및 전압의존성 29 4.1.4 Calhm1의 온도 감지 부위 32 4.1.5 Calhm1/3의 온도 민감성 34 4.2 CALHM1 이온통로의 pH 민감성 36 4.2.1 세포 외 pH와 CALHM1 36 4.2.2 자극 시간과 세포 외 pH에 의한 전압의존성 38 4.2.3 세포 내 pH와 CALHM1 41 4.2.4 세포 내·외 pH 감지 부위 44 4.2.5 알칼리 pH 감지 부위와 전압의존성 50 4.2.6 잠정적인 pH 감지 부위 52 4.2.7 산성 pH와 세포 밖 칼슘 농도 54 4.2.8 CALHM1/3의 pH 민감성 56 4.3 CALHM1 이온통로의 이황화결합 59 4.3.1 이황화결합의 위치와 이온통로의 활성 59 4.3.2 이황화결합과 세포막 발현 및 다량체 형성 62 4.3.3 시스테인 돌연변이의 작용 66 4.3.4 이황화결합의 산화·환원 반응 68 4.4 CALHM1 이온통로의 ATP 분비 70 4.5 CALHM의 간극연접 형성 72 제 5장 고 찰 76 5.1 CALHM의 온도·pH 민감성 77 5.2 Human CALHM1의 구조 81 5.3 CALHM family의 생리적 역할 83 제 6장 결 론 85 ABSTRACT 102박

(A)Study on flow vs. addictive computer game standards, for leisure and culture of adolescents

학위논문(박사)--서울대학교 대학원 :사회교육과 일반사회전공,2004.Docto

시민도덕으로서의 孝思想에 대한 비판적 연구

학위논문(석사)--서울대학교 대학원 :사회교육과 일반사회전공,1997.Maste

Analysis of the telecommunications service failures through case studies

학위논문(석사) - 한국과학기술원 : 경영공학전공, 2001.2, [ vi, 89 p. ]통신 서비스 산업은 국가의 infrastructure로써 다른 산업을 지원하는 역할을 한다. 통신 서비스의 실패는 막대한 자원의 낭비뿐만 아니라 국가 경제와 소비자에 미치는 영향이 크므로 이의 원인을 파악하고 방지하는 것은 의미 있는 일이다. 기존의 실패 관련 연구가 통계학적으로 상관관계만을 분석한데 반해 본 연구에서는 서비스 실패의 동적인 메커니즘을 분석하여 서비스가 실패하는 경로를 파악하는데 주안점을 두었다. 14종의 실패하였거나 부진한 서비스를 분석하여 여기서 공통적으로 나타나는 실패 원인과 실패의 과정을 통신 서비스 개발과정에 적용하여 서비스 실패에 대한 대응책을 제시하였다.한국과학기술원 : 경영공학전공

CPU 챠트를 이용한 통신 서비스 실패 원인 분석

As an infrastructure for all economic activities, telecommunications service industry is a fundamental building block. Considering negative impacts of its failure on the national economy and its subscribers, its very important to analyze factors leading to the failure and prevent it in advance. In our research, CUP (Cost-Utility-Preference) chart is developed to analyze the failure mechanism dynamically. It considers both the competition and customers preference of each service to explain why certain services fail. Additionally, it shows how the competitive edge of each service is changed over time. Using the chart, we can understand how the competing services interact in the market, and what mechanism leads to a service failure