고리형 디펩티드 Cyclo(His-Pro)의 신장손상 및 섬유화 개선효과와 NRF2 매개 작용기전

학위논문 (박사) -- 서울대학교 대학원 : 의과대학 임상의과학과, 2021. 2. 김연수.급성신손상은 회복되지 못하는 경우 만성콩팥병으로 진행하며 회복을 방해하는 요인으로는 염증, 산화 스트레스, 그리고 노화와 세포 사멸 등이 있으며 이를 조절하면 신질환의 진행을 억제할 수 있을 것으로 여겨지고 있다. 최근, 활성화 된 상태에서 항염증, 항산화 효과를 나타내는 전사인자 Nuclear factor erythroid-2-related factor 2 (NRF2)는 신질환 치료의 잠재적인 목표로 고려된다. 고리형 디펩티드의 일종인 cyclo-histidine-proline (cyclo(His-Pro); CHP)는 NRF2를 활성화 시키며, 신경퇴행성질환이나 당뇨병 실험 모델에서 보호 효과를 지님이 확인되었으나 신장에 미치는 효과에 관하여는 아직 알려진 바가 없어 CHP의 신보호 효과에 관하여 알아보고자 하였다. CHP 전처치는 급성 신손상을 대변하는 신장 허혈-재관류 모델에서 염증세포의 침윤, 세포 사멸, 세뇨관 손상을 뚜렷하게 감소시켰으며, 신장 기능을 보호하였다. 신장 요세관세포를 이용한 각종 산화 스트레스 모델에서 CHP 처치는 NRF2의 전사를 증가시키고, 활성화 산소의 형성 및 세포 사멸을 억제하였다. 단일 요관 폐쇄 모델에서 예방적인 CHP 전처치 및 신손상 발생후의 치료적인 CHP 투여는 신손상을 억제하였다. 만성콩팥병 동물 모델인 5/6 신절제 쥐에서 CHP치료군은 호전된 신기능과 감소된 섬유화 소견을 보였다. 만성콩팥병을 대변하기 위하여 신장세포에 TGFβ를 처리하여 섬유화를 유발하였으며, CHP 치료는 급성 세포 실험 모델에서와 유사하게 NRF2 연관 경로의 활성화를 유발하고, 활성화산소의 형성 및 세포 사망 및 노화 그리고 부분 상피간엽 이행을 억제하였다. 엑체크로마토그래피 질량분석기를 이용하여 5/6 신절제 쥐의 혈장 및 소변의 CHP의 농도와 조직에서의 NRF2 발현을 확인하였다. 5/6 신절제 쥐 모델 및 정상 대조군에서 CHP 청소율은 크레아티닌 청소율과 양의 상관관계를 보였다. 즉 낮은 CHP 청소율이 신기능이 저하된 쥐에서 동반됨을 확인하였다. 동물 및 세포 실험의 결과를 실제 환자에 적용하기 위하여 만성 신부전 환자를 만성신부전 1, 2기/ 3기/ 4, 5기의 3군으로 나누어 혈장 및 소변에서의 CHP농도 및 NRF2 조직 발현 정도를 분석하였다. 만성 신부전이 진행함에 따라 혈장 CHP농도는 증가하여 만성 신부전 4, 5기에서 가장 높은 농도를 확인하였다. 반대로, NRF2의 조직발현은 만성신부전이 진행함에 따라 감소하는 음의 상관관계를 보였다. 만성콩팥병의 진행에 따른 내인성 혈장 CHP농도의 증가는 NRF2 경로를 활성화시켜 신장을 보호하기 위한 일종의 보상작용일 것으로 생각된다. 본 연구에서 CHP는 NRF2 경로를 활성화시켜 신장 보호 효과를 나타냄을 확인하였으며, 이를 근거로 CHP의 신질환 치료제로써의 잠재적인 가능성을 제시하여 볼 수 있을 것이다.Acute kidney injury (AKI) frequently leads to chronic kidney disease (CKD) through inflammation, oxidative stress, cell senescence and apoptosis. Due to its anti-inflammatory and anti-oxidative effects, nuclear factor-erythroid-2-related factor 2 (NRF2) could be a therapeutic target of the kidney disease. While cyclic dipeptide cyclo(His-Pro) (CHP), a known NRF2 activator, has been shown to exert protective effect against neurodegenerative diseases, its effects on renal protection has not been established. Exogenous CHP pre-treatment preserved kidney function and produced significant reduction in tubular injury, apoptosis, and inflammatory cell infiltration on ischemia-reperfusion injury (IRI) model. Compared with 5/6 nephrectomy (Nx) rat, CHP-treated 5/6 Nx rat displayed restored kidney function and pathologically improved fibrosis. In the chronic in vitro model, exogenous CHP reduces reactive oxygen species (ROS) production and cell death via the NRF2 associated pathway in concordant with acute in vitro model. CHP improved kidney injury in unilateral ureteral obstruction (UUO) model with both prophylactic and therapeutic treatment regimens. To evaluate the relationship between endogenous CHP level and CKD progression, The present study measured plasma CHP concentration, and tissue expression of NRF2 in samples from CKD patients. In sham and 5/6 nephrected kidney, CHP clearance demonstrated positive relationship with creatinine clearance. Decreased CHP clearance was reported in rats with deteriorated kidney. In CKD patients, as kidney function deteriorated, plasma CHP concentration was increased. Contrarily, tissue expression of NRF2 displayed negative relationship with CKD progression. Elevated endogenous plasma CHP levels could be considered as a compensatory processes evoked to enhance the NRF2 pathway. This study has uncovered a major protective role of CHP for kidney disease through NRF2 pathway activation that could be potentiated as a therapeutic strategy.Table of Contents ABSTRACT i LIST OF TABLES iv LIST OF FIGURES v INTRODUCTION 1 METHODS AND MATERIALS 4 RESULTS 19 DISCUSSION 33 TABLES 41 FIGURES 47 REFERENCES 112 ABSTRACT (KOREAN) 123Docto

Multi-sample mass spectrometry-based approach for discovering injury markers in chronic kidney disease

Urinary proteomics studies have primarily focused on identifying markers of chronic kidney disease (CKD) progression. Here, we aimed to determine urinary markers of CKD renal parenchymal injury through proteomics analysis in animal kidney tissues and cells and in the urine of patients with CKD. Label-free quantitative proteomics analysis based on liquid chromatography-tandem mass spectrometry was performed on urine samples obtained from 6 normal controls and 9, 11, and 10 patients with CKD stages 1, 3, and 5, respectively, and on kidney tissue samples from a rat CKD model by 5/6 nephrectomy. Tandem mass tag-based quantitative proteomics analysis was performed for primary cultured glomerular endothelial cells (GECs) and proximal tubular epithelial cells (PTECs) before and after inducing 24-h hypoxia injury. Upon hierarchical clustering, out of 858 differentially expressed proteins (DEPs) in the urine of CKD patients, the levels of 416 decreased and 403 increased sequentially according to the disease stage, respectively. Among 2965 DEPs across 5/6 nephrectomized and sham-operated rat kidney tissues, 86 DEPs showed same expression patterns in the urine and kidney tissue. After cross-validation with two external animal proteome datasets, 38 DEPs were organized; only 10 DEPs, including serotransferrin, gelsolin, poly ADP-ribose polymerase 1, neuroblast differentiation-associated protein AHNAK, microtubule-associated protein 4, galectin-1, protein S, thymosin beta-4, myristoylated alanine-rich C-kinase substrate, and vimentin were finalized by screening human GECs and PTECs data. Among these ten potential candidates for universal CKD marker, validation analyses for protein S and galectin-1 were conducted. Galectin-1 was observed to have a significant inverse correlation with renal function as well as higher expression in glomerulus with chronic injury than protein S. This constitutes the first multisample proteomics study for identifying key renal-expressed proteins associated with CK