Purification and characterization of MAP Kinase from human stomach adenocarcinoma cells

임상병리학과/석사[한글] 진핵세포 내에 존재하는 Mitogen-activaed protein kinase의 존재를 확인하고, 분열촉진인자인 PMA의 자극에 대한 세포막의 수용체로부터 유전자의 발현에 이르기까지 신호전달과정에서 중간물질로 밝혀진 MAP Kinase의 성격규명을 하기 위하여 본 연구를 수행하였다. 위선암(Stomach adenocarcinoma)유래 세포주인 KHH를 10% fetal bovine serum이 첨가된 DMEM 배지에서 배양한 후, 혈청을 제거한 배지에서 약 18시간정도 배양시킨 뒤 PMA를 최종 0.1㎍/㎖의 농도로 5분간 처리하였다. 이와 같이 처리한 세포는 파쇄완충액 내에서 27 gauge이하와 주사기로 10회 이상 왕복하여 깨트려서 세포파쇄액을 모은 다음 원심분리하고 상층액만을 모아 QAE,Heparin sepharose, Phenyl supherose의 순서로 chromatography를 실시하여 순수한 MAP Kinase를 분리하였다. 각 단계마다 단백질이 존재하는 분획만을 몇개로 나누어 적은 양의 분획은 centricon으로 많은 양의 분획은 concentrator를 이용하여 농축하고, 농축된 단백질중 MAP kinase가 존재하는 지를 MBP를 기질로 하여 kinase 반응을 실시한 뒤 MBP가 인산화되었는지는 phosphoserine과 phosphothreonine에 대한 단일 항체를 이용하여 western blot을 실시하고 chemiluminescence 방법으로 확인하였다. MAP kinase의 기질에 대한 실험은 유전자 재조합 p56**lck 를 이용하여 다음과 같이 실시하였다. p56**lck 의 N-terminal을 coding하는 유전자가 삽입된 pGEX-3Xb plasmid vector를 CaCl^^2 로 처리하여 competent E.coli로 만든 DH5α에 42℃에서 90초간 heat shock하여 형질전환(transformation) 시킨 후, ampicillin을 첨가한 선택배지애서 배양하였다. 증식된 집락을 이용하여 DNA Miniprep을 통하여 plasmid DNA를 분리하고 EcoR I와 EcoR V endonuclease처리 후 전기dud동하여 형질도입 여부를 확인하였다. 이와같이 pGEX-3Xb p lasmid가 형질도입된 E.coli DH5α를 LB broth 배지에서 배양한 뒤 지수증식기 후반에 IPTG를 처리하여 GST-fusion 단백질의 생성을 induction시킨 다음, 원심분리하여 세균만을 모았다. 모아진 세균은 동결 및 융해의 과정을 3-5회 반복하여 파쇄하고 원심분리하여 상 층액을 회수하였다. 상층액중의 GST-fusion 단백질은 glutathione sepharose 4B와 상온에서 1시간 가량 흔들면서 반응한 뒤 분리 및 정제하였다. PMA 처리 시간에 따른 MAP kinase의 인산화정도는 SDS-PAGB후 western blot하고 anti-BRKI Ab로 확인한 결과, 5-10분에서 최대의 인산화가 나타났고 20분 경과 후에는 탈 인산화되어지는 것으로 관찰되었다. 이상의 결과를 통해 분리되어진 MAP kinase는 진핵세포에서의 신호전달 체계애서 세포 표면의 수용체로부터 유발된 신호를 MAP kinase kinase등으로 부터 받아 신호전달 과정의 하위 단백질의 serine과 threonine 부위에 인산화 시키는 serine/threonine kinase로서 작용한다는 것을 확인할 수 있었고, in vitro상에서 기질로 다른 실험자등의 보고에서와 같이 Myeline basic protein을 인산화시켰다. 그리고 PMA 처리시 약 5-10분 정도에서 가장 인산화가 많이 진행되고 20분 경과시에는 탈인산화 되는 것을 확인하였다. [영문] MAP kinases are a family of serine/threonine specific protein kinases becoming activated in response to different proliferative stimuli by phocphorylation at both threonine and tyrosine residue. Present study shows that MAP kinase was purified from KHH, human stomach adenocarcinoma cell, by QAE sepharose, heparin sepharose, phenyl supherose chromatography and identified by western blotting. Purified MAP kinase has an M.W of 44kDa and phosphorylates myelin basic protein. Also MAP kinases were rapidly phosphorylated in a few minutes then dephosphorylated within 20min according to the PMA treatment time. Immnublotting analysis with anti-ERKI Ab to the crude extract of cell lysis solution shows 42, 44, 54kDa and other minor bands but final solution elected from phenyl supherose shows only 44kDa band. It was reported that N-terminal of p561**lck was phosphorylated by MAP kinasein vitro. Cloned p56**lck in PGEX-3Xb plasmid was transformed to DH5α strain of E, coli by using CaCl^^2 . Transformed E.coli express GST-fushion proteins then GST-fushion proteins were purified with glutathione sepharose 4B. Purified GST-fushion proteins were analysed by SDS-PAGE. 77 amino acid coding DNA cloned plasmid and 123 amino acid coding DNA cloned placid chow M.W of 35, 38.5kDa respectively, As a result of experiments, it was revealed that MAP kinase isoforms located within a human stomach adenocarcinoma cells and 44kDa MAP kinase was purified. Purified MAP kinase has kinase activity to MBP and is rapidly phosphorylated according to the PMA treatment.restrictio

Role of colloidal material in the cycling of 210Pb and 210Po in the ocean

Thesis(master`s)--서울대학교 대학원 :지구환경과학부,2006.Maste