Enhanced Production of tylosin derivative in Streptomyces venezuelae

☞ 이 논문은 저자가 원문공개에 동의하지 않은 논문으로, 도서관 내에서만 열람이 가능하며, 인쇄 및 저장은 불가합니다.The tylosin polyketide synthase (PKS) tylGI-V genes were cloned into two compatible replicating vectors each under the control of pikAI promoter. These two replicating plasmids, pBB155 containing tylGI-III and pDHS3003 containing tylGVI-V were individually introduced into an engineered strain of Streptomyces venezuelae bearing a deletion of pikromycin PKS gene cluster (DHS2001). The resulting mutant strain (YJ005) successfully produced the 16-membered ring macrolactone (tylactone) and its glycosylated form (desosaminyl tylactone). We also cloned the last two Tyl PKS genes, tylGIV-V into an integrating vector to generate pYJ229 and transformed it and pBB155 into DHS2001. The mutant strain (YJ058) produced tylactone and its derivative 10-fold less than YJ005, demonstrating that the use of a replicating plasmid for expression of tylGVI-V are more suitable than that of an integrating plasmid. To improve the production level of tylactone and its derivative, global regulatory genes (afsR2), a gene encoding crotonyl-CoA reductase (ccr) involved in the biosynthesis of tylosin precursor, ethylmalonyl-CoA, and the tylosin type II thioesterase (TEII) named tylO were cloned into an integrating vector pSET152 and transformed into YJ005. Introduction of afsR2, ccr and tylO genes led to no observable effect on the productivity of tylactone. However, the mutant strain transformed by endogeneous pathway specific regulatory gene, pikD produced 3.4-fold enhanced tylactone and 18-fold improved desosaminyl-tylactone, demonstrating the regulatory protein PikD triggered the enhanced expression of Tyl PKS as well as desosamine (des) biosynthetic gene cluster to promote the productivity of tylactone and its glycosylated form.;본 논문은 방선균 Streptomyces venezuelae를 이종숙주로 하여, 광범위한 동물의 호흡기 질병의 예방과 치료에 사용되고 있는 폴리케타이드(polyketide)계열 항생제인 tylosin유도체의 생산성을 향상 시키기 위한 다양한 분자유전학 적인 방법에 관한 연구 결과이다. 본 연구의 목적은 폴리케타이드의 고생산 관련 유전자로 알려진 유전자의 도입을 통해 이종숙주에서 tylosin유도체의 생산성을 증대시키는 것이다. 본 연구에서 이종숙주로 사용된 균주인 S. venezuelae는 다른 방선균들과 비교하여 성장 속도가 2배 이상 빠르며 transformation 등의 유전자 조작이 매우 용이하고 gene disruption이나 deletion에 필요한 chromosome 상의 homologous recombination에 의한 double crossover가 용이한 장점이 있으므로 발현용 또는 조합 생합성의 이종 숙주로서 개발할 가치가 매우 높은 균주이다. S. venezuelae의 pikromycin (pik) polyketide synthase (PKS)제거 균주인 DHS2001에 두 종류의 SCP2*를 기반으로 한 low-copy replicating plasmid를 이용하여 tylosin PKS (Tyl PKS)의 발현 결과 tylosin전구체인 tylactone (tylosin aglycone)과 소량의 desosaminyl tylactone이 생산됨을 확인 하였다. 이 결과를 토대로 polyketide의 aglycone의 생합성 과정에 작용하여 생산량 증대를 기대할 수 있는 유전자 2가지와 polyketide 항생제 생산의 조절유전자 2가지를 선별하여 tylosin유도체의 이종생산 균주에 도입하여 각 유전자의 발현이 tylactone 및 tylosin유도체의 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 본 연구에서 aglycone생성과 관련된 유전자로서 tylosin을 생산하는 야생균주인 Streptomyces fradiae에서 두 유전자, crotonyl-CoA reductase의 유전자 (ccr)와 type II thioseterase 유전자 (tylO)를 선별하였다. CCR은 tylosin의 유도체인 aglycone생성의 전구체인 ethylmalonyl-CoA의 생합성의 효소로 알려져 있다. 그리고 TylO는 tylosin의 생합성 시에 잘못된 중간체, extender unit이나 starter unit에 사용되는 acyl-CoA substrates의 non-specific loading을 hydrolysis하는 editing작용을 한다고 알려져 있다. 조절 유전자로 선별된 afsR2는 Streptomyces lividans에서 항생제 생산을 크게 증가시키는 global regulatory 유전자이며, pikD는 S. venezuelae 내에서의 Pik PKS의 발현에 activator로 작용하는 pathway-specific 조절 유전자이다. 이들 유전자의 도입결과 tylO와 afsR2는 S. venezuelae내에서의 Tyl PKS발현에 효과를 나타내지 못했다. Crotonyl-CoA reductase의 유전자 (ccr)로 형질 전환된 균주의 경우도 tylactone 및 desosaminyl tylactone의 생산량이 YJ005 균주와 동일하였다. 추가적으로 YJ005-ccr 균주와 YJ005 균주에 ccr 유전자의 substrate인 crotonate 10mM을 첨가해 주었을 때 두 균주 모두 동일한 2.1배 정도의 생산성 증대를 확인하였다. Crotonate의 첨가를 통한 tylactone 및 desosaminyl tylactone의 생산량의 증대는 ccr 유전자의 도입과 무관하며, 이는 S. venezuelae에서 CCR과 유사한 역할을 하는 효소가 충분히 존재하여 ethylmalonyl-CoA precursor pool을 증가시키고, 나아가 tylactone의 생산량 증대에 기여했을 것으로 추측된다. PikD를 도입한 돌연변이 균주의 경우 tylosin유도체인 tylactone의 생산량이 3.2배 증가 했을 뿐만 아니라 desosaminyl tylactone의 생산량도 18배 이상 증가하였다. 이는 PikD 조절유전자가 PKS 발현 및 desosamine의 당합성 관련 유전자의 전사 (transcription)를 촉진한 결과로 예측된다. 본 연구의 pikD를 도입한 균주의 이러한 결과는 경제적 관점에서 생리활성을 나타내는데 중요한 요소인 당치환체의 증대를 가져왔다는 점에서 높은 이점을 가진다. S. venezuelae에 Tyl PKS이종발현 돌연변이체의 pikD유전자 도입균주의 전사와 단백질 수준에서의 과발현 정도를 확인해 봄으로써 pikD의 과발현을 통한 desosaminyl tylactone의 증대 이유도 밝힐 수 있을 것이다.I. 서론 1 A. 미생물과 이차 대사 (Secondary Metabolite) 1 B. 방선균 (Actinomycete) 2 B-1. 방선균의 분류 2 B-2. 방선균의 이용 2 C. 폴리케타이드 (Polyketide) 5 C-1. Polyketide 5 C-2. Polyketide의 생합성 5 C-3. Polyketide editing enzyme : Type II thioseterase (TE II) 13 C-4. Polyketide 생합성의 전구체 합성 유전자 : ccr 13 C-5. Post-PKS modification 14 C-5-가. 당화 과정 (glycosylation) 15 C-5-나. 수산화 과정 (hydroxylation) 16 D. Tylosin과 이종숙주(Heterologous Host) 발현 19 D-1. Tylosin 19 D-2. Tylosin 유도체 생산을 위한 이종 숙주로서의 Streptomyces venezuelae 19 E. 방선균의 이차대사산물 생산 조절과 조절유전자 25 E-1 방선균에서 이차대사산물의 조절인자 25 E-2. PikD 27 E-3. AfsR2 27 E-4 방선균에서 이차대사산물의 조절기작 28 F. 연구 방향 31 II. 재료 및 방법 Ａ. 균주 및 실험 방법과 사용 배지 32 B. 이종숙주 다중발현을 위한 벡터의 제작과 고생산 유전자 발현 벡터의 제작 33 B-1. pYJ203,pYJ204와 pYJ205의 제작 33 B-2. pYJ229의 제작 33 B-3. pYJ205-ccr, pYJ205-tylO, pYJ205-afsR2 pYJ205-pikD의 제작 34 C. 다중 발현 벡터 조합을 이용한 YJ058균주 제작 40 D. 고생산 유전자의 클로닝 및 균주의 제작 40 E. Tylosin유도체의 생산과 분석 조건 41 E-1. Tylosin 유도체의 생산과 추출방법 41 E-2. Tylosin 유도체의 분석 41 III. 결과 및 고찰 A. 동시 발현 벡터 조합을 이용한 tylosin유도체의 생산 45 B. 고생산 유전자를 이용한 Tylosin 유도체의 생산성 증대 49 B-1. 이종숙주의 고생산성 관련 유전자 선별 및 클로닝 49 B-2. 고생산 관련 유전자의 도입을 통한 tylosin 유도체 고생산 균주 개발 51 B-2-가. ethylmalonyl-CoA 합성 유전자인 ccr 과 Tyl PKS editing enzyme 유전자인 tylO의 도입을 통한 생산성 증대 51 B-2-나. 조절 유전자 pikD 및 afsR2 유전자 도입을 통한 생산성 증대 55 IV. 결론 60 V. 참고문헌 62 VI. ABSTRACT 6

Ge(100)표면 위의 purine 분자의 흡착에 관한 연구

학위논문(석사) - 한국과학기술원 : 화학과, 2004.2, [ vi, 39 p. ]The adsorption of purine on Ge(100) has been investigated using Auger electron spectroscopy (AES), temperature-programmed desorption (TPD), scanning tunneling microscopy (STM) and the density functional theory (DFT) calculation. From the ratio of C(KLL) / Ge(MNN) Auger peak intensities, we find that the surface coverage of purine molecules increases with increasing the exposure and reached saturation after the dosing of 8 minutes (θ = 0.25 ML). In TPD spectra, both chemisorbed and physisorbed purine molecules are observed to be present at the temperature of 110 K. Chemisorbed purine molecularly desorbs at 620 K while physisorbed purine at 140 K. It is also found that Purine molecularly desorbed following the first order kinetics, and the desorption energy is 38.67 kcal/mol. The STM image shows that the adsorbed purine molecules reside between the the buckled dimmer rows and bind to the down Ge atoms of the dimers forming local c(4×2) and p(2×2) reconstructions. Accordiong to the DFT calculation based on a four-dimer Ge cluster, the energetcially most stable adsorption geometry is that purine is chemisorbed on Ge(100) making two dative bonds between two N-atoms of purine and down atoms in Ge dimer. These results are in good agreement with the the experimental results.한국과학기술원 : 화학과

Ge(100) 표면 위에서 생/유기 분자들의 흡착구조와 반응메커니즘 연구

학위논문(박사) - 한국과학기술원 : 화학과, 2008.2, [ xii, 127 p. ]My main research interest for my graduated studies was to develop new ways to control the attachment of organic molecules on the semiconductor surfaces and to understand their interfacial architecture at the atomic level. For my Ph. D thesis work, I have interested the adsorption structure and mechanism of simple gas phase molecules: $H_2$, liquid phase molecules: pyrimidine $(C_4H_4N_2)$, water $(H_2O)$, thiophene $(C_4H_4S)$ and the complex solid phase molecules: purine $(C_5H_4N_4)$, histidine $(C_6H_9N_3O_2)$. The thesis consists of five chapters. Summaries of each chapters are as follows. Study of the adsorption and decomposition of $H_2O$ on Ge(100) The adsorption and decomposition of water on Ge(100) have been investigated using real-time scanning tunneling microscopy (STM) and density-functional theory (DFT) calculations. The STM results revealed two distinct adsorption features of $H_2O$ on Ge(100) corresponding to molecular adsorption and H-OH dissociative adsorption. In the molecular adsorption geometry, $H_2O$ molecules are bound to the surface via Ge-O dative bonds between the O atom of $H_2O$ and the electrophillic down atom of the Ge dimer. In the dissociative adsorption geometry, the $H_2O$ molecule dissociates into H and OH, which bind covalently to a Ge-Ge dimer on Ge(100) in a H-Ge-Ge-OH configuration. The DFT calculations showed that the dissociative adsorption geometry is more stable than the molecular adsorption geometry. This finding is consistent with the STM results, which showed that the dissociative product becomes dominant as the $H_2O$ coverage is increased. The simulated STM images agreed very well with the experimental images. In the real-time STM experiments, we also observed a structural transformation of the $H_2O$ molecule from the molecular adsorption to the dissociative adsorption geometry. Cyclo-addition reaction of Lewis acidic molecule: $AlCl_3$ The adsorption and decomposition of $AlCl_3$ on Ge(100) was studied u...한국과학기술원 : 화학과

Ge(100) 표면 위의 thiophene 분자의 흡착구조 및 결합상태에 관한 연구

학위논문(석사) - 한국과학기술원 : 화학과, 2006, [ vi, 47 p. ]We have studied the adsorption geometry and the bonding state of the thiophene molecule on the Ge(100) surface using hybrid density functional theory (DFT) calculations, scanning tunneling microscopy (STM), and high resolution core-level photoemission spectroscopy (HRPES). STM images show that thiophene molecules preferentially form one-dimensional molecular chains on Ge(100) under 0.25 ML at room temperature. At high coverage (over 0.25 ML), the thermodynamically stable features are additionally observed between adjacent molecular chains. In HRPES study, we observe three bonding states; a weakly bound state, a chemisorption state, and a decomposition state, change systematically depending on the molecular coverage and the annealing temperature. From the findings, we demonstrate under 0.25 ML, thiophene molecules adsorb on Ge(100) by the Lewis acid-base reaction. At high coverage, over 0.25 ML, additional thiophene molecules are adsorbed through the [4+2] cycloaddition reaction. Temperature dependent behaviors of thiophene on Ge(100) suggest that the dative bondig thiophene desorb followed by the [4+2] cycloaddition reaction product as the molecular thiophene or decompose to form metallocyclic compounds and sulfur atoms.한국과학기술원 : 화학과

Morphological Differences of the Wound Healing in Secretory Leukocyte Protease Inhibitor Knockout Mice

분비백혈구단백분해효소억제제(secretory leukocyte protease inhibitor, SLPI)는 세린계열의 단백분해 억제제로 점액에서 주로 발견되며 항미생물 작용을 지니고 있다. SLPI는 약 12kD의 분자량을 지니며 아교질과 fibronectin과 같은 구조 단백질의 과도한 분해를 억제한다. 손상된 조직의 치유는 과도한 단백질의 분해와 박테리아의 감염을 특징적으로 지니고 있으므로 상처의 치유가 느리게 진행된다. 이에 Slpi 유전자가 결손된 생쥐를 이용하여 피부에 상처를 유도한 후 1, 3, 5, 7일째에 조직을 적출하여 다양한 조직화학적 염색법과 면역조직화학적 방법 및 RNase protection 방법 등을 이용하여 상처치유과정을 분석하였다. 조직학적인 분석결과 상처 유도 후, Slpi 결손 생쥐의 적출된 모든 피부조직에서 회복과정이 대조군의 생쥐에 비해 느렸으며, 다수의 염증반응세포들이 장기간 상처부위에 남아 있었다. 또한, Slpi 결손 생쥐에서 아교질의 침착이 느리게 진행되었으며 조직 장력 역시 낮은 것으로 확인되었다. RNase protection 결과로 발현되는 사이토카인 중 TGF-β1의 발현이 Slpi 결손 생쥐에서 증가되었다. 이러한 결과를 종합해 보면 SLPI는 피부의 상처회복에서 상피세포의 이동, 염증반응세포의 유입조절 등에 관여할 것으로 생각된다. Secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI) is a serine protease inhibitor with anti-microbial properties found in mucosal fluids. At the tissue level, the ability of this 12kDa protein is to counteract the excessive degradation of functional and structural proteins such as collagen and fibronectin. Impaired healing states are characterized by excessive proteolysis and often bacterial infection, leading to the hypothesis that SLPI may have a role in this process. To investigate the role of SLPI in skin how it contributes to tissue repair, we have generated mice null for the gene encoding SLPI (Slpi), which show impaired cutaneous wound healing with increased inflammation. For the purpose of this, we have performed wound experiment in skin tissue with morphometrical analyses, immunohistochemistry, and Rnase protection assay. From these analyses, the results were that delayed healing in KO mice wounds compared to that of WT, prolonged inflammatory phase and increased TGF-β1 in KO wounds, and lower mechanical properties in KO wounds. Taken together, SLPI may play a cruical role in cutaneous wounds healing especially in matrix reorganization that suggests the development as a clinical drug for wound healing.이 논문은 정부재원(교육인적자원부 학술연구조성사업비)으로 한국학술진흥재단의 지원을 받아 연구되었음(R08-2003-000-10279-0)

Differential Expression of System L Amino Acid Transporters in Wound Healing Process of Rat Skin

상처치유 과정에는 계속적인 세포성장과 증식이 필수적이며, 이러한 과정에 영양물질 수송체의 역할은 필수적이라고 할 수 있다. 아미노산 수송계 L은 중성아미노산을 수송하는 세포막 단백질로서 종양세포를 포함한 대부분의 세포에서 중성아미노산의 주 경로가 되는 아미노산 수송계로 알려져 있다. 본 연구는 상처를 유발시킨 흰쥐를 이용하여 상처치유 과정에서 아미노산 수송계 L의 발현양상 및 역할을 밝히고자 하였다. 동일조건 하에서 일정기간 사육한 흰쥐의 피부에 상처를 유발시킨 후, 12시간, 1일, 3일, 5일, 7일째에 조직을 적출하여 역전사-중합효소 연쇄반응과 면역조직화학적 분석 등을 이용하여 상처치유 과정에서 아미노산 수송계 L의 발현을 분석하였다. LAT1의 발현은 상처유발 후 12시간째에 증가가 있었으며, 1일, 3일, 5일 및 7일째로 경과하면서 대조군과 점차 유사해졌다. LAT2의 발현은 상처유발 후 1일과 3일까지 증가하였으며, 5일과 7일째로 경과하면서 대조군과 점차 유사해졌다. 본 연구의 결과로서 중성아미노산 수송계 L 중, LAT1은 세포손상 후 상처치유과정의 초기단계에서 중요한 역할을 하며, LAT2는 상처치유 기간에서 점차 정상으로 진행되어가는 중기단계에서 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.한국과학재단 목적기초연구(R01-2005-000-10135-0

구강점막의 창상치유에 대한 식나무(Aucuba japonica) 추출물의 효과

Aucuba japonica has variable pharmacological effects such as hepatoprotective, choleretic, hemodynamic, antimicrobial, and anti-inflammatory activities. This study was performed to investigate the effects of Aucuba japonica extract on oral wound healing. Aucubin was extracted from Aucuba japonica, and injected on either side of buccal mucosa of male mice. Artificial full thickness wounds were made on the site with 1.5 mm biopsy punch under sterile technique. The specimens had taken on day 1, 3, and 5 with 4 mm biopsy punch. Light microscopic examination and quantitative histologic analysis were performed for reepithelization, inflammatory cell infiltration. Reepithelization of the aucubin (0.1%) group was earlier than the control group. And the number of inflammatory cells of the aucubin group was lesser than the control group. In view of the results so far achieved, the aucubin extracted from Aucuba japonica may be useful for oral wound healing and it can be applied as a topical agent on the oral wound. Further research should be performed on the mechanism of aucubin on oral wound healing and proper formulation for effective topical agents