Characterization of dUTPase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus sp. NA1

As a part of genomic research of the Thermococcus sp. NA1 (TNA1), the hyperthermophilic archaea collected from a deep-sea hydrothermal vent area, a gene whose deduced amino acid sequence had high similarity to the gene encoding the dUTPase from Pyrococcus woesei and P. furiosus (83% identity and 93% similarity) was revealed. The dUTPase encoding gene comprises open reading frame of 468 bp with valine at the N-terminus, corresponding to polypeptides of 156 amino acids with predicted molecular mass of 17,679 Da and pI of 8.1. To characterize the dUTPase, the gene was cloned and overexpressed in Escherichia coli Rosetta(DE3)pLysS with the pET-24a(+) vector system. The His6-tagged TNA1 dUTPase was purified on Co2+-IMAC-Sepharose, dialyzed, and the enzyme activity was investigated. TNA1 dUTPase was capable of converting dUTP to dUMP and inorganic phosphate and enhanced the PCR in a broader range of target lengths in combination with TNA1 DNA polymerase. TNA1 dUTPase also increased the yield of products amplified with other archaeal DNA polymerases.2

Characterization of a dITPase from the Hyperthermophilic Archaeon Thermococcus onnurineus NA1 and its Application in PCR Amplification

In this study, we found that dITP could inhibit PCR amplification of various family B-type DNA polymerases, and 0.93% dITP was spontaneously generated from dATP during PCR amplification. Thus, it was hypothesized that the generated dITP might have negative effect on PCR amplification of family B-type DNA polymerases. To overcome the inhibitory effect of dITP during PCR amplification, a dITP pyrophosphatase (dITPase) from Thermococcus onnurineus NA1 (TNA1) was applied to PCR amplification. Genomic analysis of the hyperthermophilic archaeon T. onnurineus NA1 revealed the presence of a 555-bp open reading frame with 48% similarity to HAM1-like dITPase from Methanocaldococcus jannaschii DSM2661 (NP_247195). The dITPase-encoding gene was cloned and expressed in Escherichia coli. The purified protein hydrolyzed dITP, not dUTP. Addition of the purified protein to PCR reactions using DNA polymerases from T. onnurineus NA1 and Pyrococcus furiosus significantly increased product yield, overcoming the inhibitory effect of dITP. This study shows the first representation that removing dITP using a dITPase enhances the PCR amplification yield of family B-type DNA polymerase.[This work was supported by KORDI in-house program (PE98210) and the Marine and Extreme Genome Research Center program of Ministry of Land, Transport and Maritime Affairs, Republic of Korea]1

Hyperthermophilic dUTPase and Methods of Preparation Thereof

본 발명은 고호열성 디유티피아제(dUTPase) 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, Thermococcus sp. 균주로 부터 분리되어진 신규의 고호열성 dUTPase 및 이의 기능적 동등물, 이들의 아미노산 서열을 가진 단백질 및 고호열성 dUTPase 생산방법을 제공한다. 본 발명에 따른 dUTPase는 고호열성이며, PCR 반응시 첨가가능 하며, PCR 반응액에 존재하는 dUTP로 인한 높은 충실도 DNA 중합효소의 정지현상을 줄여서, 정밀한 PCR이 요구되는 정밀분석, 정밀진단. 동정 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다

Mutant DNA Polymerases and Their Genes From Themococcus

본 발명은 써모코커스 유래 돌연변이 DNA 중합효소들 및 그의 유전자들에 관한 것으로서, 보다 상세하게 는 써모코커스 속 NA1 (Thermococcus sp. NA1) 균주로부터 분리되고 특정 부위에 돌연변이화 (site- directed mutagenesis)를 유발시킨 DNA 중합효소들, 그의 아미노산 서열들, 상기 돌연변이 DNA 중합효소 유전자들, 그의 염기 서열들 및 이를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 숙주 세포 및 상기 숙주세포를 이용한 돌연변이 DNA 중합효소 단백질 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 돌연변이 DNA 중합효소는 기존 야생형 DNA 중합효소와 비교하여 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성 부위에 돌연변이화 가 유발되어 진행도(processivity)를 증가시켜서 PCR에 있어서 다양한 분자유전학적 기술 등에 널리 응용 될 수 있다

Sensing domain and extension rate of a family B-type DNA polymerase determine the stalling at a deaminated base

The uracil-sensing domain in archaeal family B-type DNA polymerases recognizes the pro-mutagenic uracil in the DNA template, which leads to the stalling of DNA polymerases. Here, we describe our new findings regarding the recognition spectrum of the uracil-sensing domain of family B-type DNA polymerases, the molecular mechanism underpinning the stalling of polymerases, and a method to increase the efficiency of PCR amplification. The uracil-sensing domain of Pfu DNA polymerase appears to recognize hypoxanthine as well as uracil, as confirmed by primer extension assay, mutation study and molecular docking. Interestingly, we observed that two successive deaminated bases were required to stall TNA1 and KOD DNA polymerases while a single deaminated base was enough for stalling Pfu polymerase in spite of the virtually identical uracil-sensing domain. The facts that TNA1 and KOD DNA polymerases retain much higher extension rates than Pfu DNA polymerase and decrease of extension rate resulted in stalling TNA1 and KOD DNA polymerases at a single deaminated base, strongly suggest that the stalling is determined by the extension rate of DNA polymerases along with possessing uracil-sensing domain. It was demonstrated that dITP is spontaneously generated during PCR amplification and dITPase activity of HAM1-like protein from Thermococcus onnurineus NA1 enhances the PCR amplification yield of TNA1 and Pfu DNA polymerases.1

Thermococcus spp.로부터 분리된 신규한 수소화효소, 이를 암호화하는 유전자 및 그 유전자를 갖는 미생물을 이용하여 수소를 생산하는 방법

발명요약

Phosphatase of Sequence Number 6 and Genes Encoding it

본 발명은 Thermococcus 속에 속하는 고호열성 신균주로부터 분리한 신규한 포스파타제(Phosphatase) 및 이를 암호화하는 유전자에 관한 것이다. 본 발명의 포스파타제는 고온에서도 열안정성을 갖기 때문에 특 정 단백질이나 DNA 대상체를 검출하기 위한 마커 등으로 널리 이용될 수 있다

Mutant DNA Polymerases and Their Genes)

본 발명은 돌연변이 DNA 중합효소들, 그의 유전자들 및 그들의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 써 모코커스 속 NA1 (Thermococcus sp. NA1) 균주로부터 분리되고 특정 부위에 다중의 돌연변이화 (site- directed mutagenesis)를 유발시킨 DNA 중합효소들, 그의 아미노산 서열들, 상기 돌연변이 DNA 중합효소 유전자들, 그의 염기 서열들 및 이들을 중합효소 연쇄반응 (PCR) 등에 사용하는 용도에 관한 것이다. 본 발명의 돌연변이 DNA 중합효소는 기존 야생형 DNA 중합효소와 비교하여 프루프리딩 (proofreading) 활성저 하와 이노신 감지 (inosine sensing) 기능을 효과적으로 변화시키어 보다 특이염기를 포함하는 프라이머 를 이용한 중합연쇄반응이 신속하게 진행되게 하므로, PCR 을 포함한 다양한 분자유전학적 기술 등에 널 리 응용될 수 있다

Protein For Enhancing DNA Polymerase Activity and Genes Encoding it

본 발명은 DNA 중합효소 활성 증가 단백질 및 이를 암호화 하는 유전자에 관한 것으로서, 보다 상세하게 는 Thermococcus sp. NA1으로부터 유래되어진 DNA 중합효소 활성 증가 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 단백질을 암호화하는 분리되어진 유전자 단편을 제공하며, 이를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 숙주 세포 및 상기 숙주세포를 이용한 DNA 중합효소 활성 증가 단백질 생산방법 에 관한 것이다

Thermococcus spp.로부터 분리된 신규한 수소화효소, 이를 암호화하는 유전자 및 그 유전자를 갖는 미생물을 이용하여 수소를 생산하는 방법

발명요약