Evaluation of the Efficacy of a Novel TCR-Like Antibody Model Targeting OVA 257-264/H-2Kb Complex

T Cell Receptor (TCR)-like antibodies, designed to mimic CD8 + T-cell receptors and recognize antigen-specific MHC-peptide complexes, are capable of targeting low-density antigens. As a form of immunotherapy, TCR-like antibodies have been reported to have therapeutic effects on cancer cells or virus-infected cells. To obtain a TCR-like antibody model for a specific MHC-CTL epitope complex, scFv (single-chain antibody Fv domain) that recognizes the H-2Kb bound to OVA 257-264 (SIINFEKL), an immunodominant epitope of ovalbumin (OVAp/H-2Kb), was obtained by screening the bacteriophage library. Then, the human IgG1-OVA monoclonal antibody (KbOv-27 mAb) was prepared by separating VH and VL from this scFv and converting them into human whole IgG form. To evaluate the efficacy of this antibody, the ability of the KbOV-27 mAb to specifically recognize cells with the OVAp/H-2Kb complex was examined. The OVA 257-264 peptide was attached to EL4 cells, a murine lymphoma cell line with H-2Kb expression, and the specific binding of KbOv-27 mAb was tested. The experiment demonstrated that the amount of KbOv-27 mAb binding was proportional to the pMHC complex density. Quantitative determination of the binding affinity of KbOv-27 mAb revealed a KD value of 2.83μM. To test whether naturally processed antigens can be recognized by KbOv-27 mAb, splenocytes obtained from OT-I mice were infected with OVA-expressing recombinant vaccinia virus (VV-OVA) and analyzed by flow cytometry. The results showed that KbOv-27 mAb could bind the OVAp/H2Kb complex presented by the infected macrophages. Finally, to examine whether KbOv-27 mAb can induce the death of OVAp/H2Kb expressing cells in vivo, C57BL/6 mice were injected with either the C57BL/6 mouse splenocytes pulsed with OVA 257-264 peptide (target cells) which were already bound to KbOv-27 mAb or the target cells and the antibody separately in the tail vein. The result showed that KbOv-27 mAb was able to specifically remove the OVA257-264 pulsed target cells in vivo as well. These results demonstrate that KbOv-27 mAb specifically recognizes the OVAp/H-2Kb complex and induces specific elimination of OVAp/H-2Kb-presenting target cells in the body. This study provides a proof of concept of TCR-like antibodies, suggesting that these antibodies could be widely used for diagnosis or anticancer and antiviral therapy.;CD8+T-cell의 수용체를 모방하여 항원에 특이적인 MHC-펩타이드 복합체를 인식할 수 있도록 만들어진 T Cell Receptor (TCR)-like antibody는 밀집도가 낮은 항원을 표적으로 삼을 수 있다. 이는 면역요법 중 하나로서 TCR-like antibody는 암세포 혹은 바이러스 감염 세포에 치료효과를 나타내는 연구가 보고된 바 있다. 이를 토대로 우리는 특정 MHC-CTL 에피토프 복합체에 대한 TCR-like antibody 모델을 얻기 위해 박테리오파지 라이브러리 스크리닝을 통하여 Ovalbumin(OVA)의 면역 우세 항원결정기(epitope)인 OVA 257-264 (SIINFEKL) 펩타이드가 결합한 H-2Kb 복합체(OVAp/H-2Kb)의 scFv (single-chain antibody Fv domain)를 얻었다. 이 scFv에서 분리한 VH, VL을 Human Whole IgG 형태에 전환시켜 Human IgG1-OVA 단클론 항체(KbOv-27 단클론 항체)를 제작하였다. KbOv-27 단클론 항체의 특징을 평가하기 위해, KbOV-27 단클론 항체가 OVAp/H-2Kb 복합체를 갖는 세포를 특이적으로 인식할 수 있는지 알아보았다. 마우스 림프종 세포주인 EL4 세포에 OVA 257-264 펩타이드를 pulsing하여 KbOv-27 단클론 항체의 특이적 결합 유무를 확인하였다. 실험결과는 KbOv-27 단클론 항체가 pMHC 복합체 밀도에 의존적으로 반응하였다. KbOV-27 단클론 항체와 항원간의 dissociation constant가 2.83uM(KD)정도 친화력을 나타내었다. 이 항체가 자연처리항원을 인식할 수 있는지 알아보기 위해, 시험관 내에서 OVA를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 (VV-OVA) 를 OT-I 마우스 비장세포에 감염시킨 후에 대식세포에서 제시되는 OVAp/H-2Kb 복합체에 KbOv27 단클론 항체가 결합하는 것을 유동 세포 분석법으로 확인하였다. 마우스 생체 내에서 KbOv-27 단클론 항체가 살해 활성(Killing Activity)능력이 있는지 확인하기 위해, OVA 257-264 펩타이드를 pulsing한 C57BL/6 마우스 비장세포에 KbOv-27 단클론 항체를 결합시켜 주입하고, 표적세포와 KbOV-27 단클론 항체를 각각 C57BL/6 마우스의 꼬리정맥으로 투여하였다. 그 결과, KbOv-27 단클론 항체가 OVA 257-264를 갖는 표적세포를 특이적으로 제거하는 것을 확인 하였다. 이상의 결과를 통해 KbOv-27 단클론 항체가 OVAp/H-2Kb 복합체만을 특이적으로 인식하고 체내에 있는 표적 세포를 제거할 수 있다는 것이 입증되었다. 그리고 TCR-like antibody의 개념을 검증하여 이러한 항체가 진단 또는 항암 및 항바이러스 치료에 사용될 수 있는 가능성을 제시한다.ABSTRACT 1 I. INTRODUCTION 3 II. MATRIALS AND METHODs 6 1. Generation of TCR-like antibodies 6 2. Cell lines and Culture 7 3. Peptides and peptide/H-2Kb complexes 7 4. Mouse 7 5. Cell staining 8 6. Surface plasmon resonance 8 7. Macrophage detection in virus-infected splenocytes 9 8. The killing activity of KbOv-27 mAb 9 9. Statistical methods 10 III. RESULTS 11 1. Screening and production of TCR-like antibody 11 2. Binding characteristics of TCR-like antibody KbOv-27 12 3. Detection of cell population with OVAp/H-2Kb complex in homogeneous cell population 16 4. Binding affinity of the KbOv-27 mAb 18 5. Detection of peptide/MHC complex of VV-OVA infected cells in vitro by KbOV-27 mAb 21 6. KbOv-27 mAbs ability to remove target cells in vivo 23 IV. DISCUSSION 26 REFERENCES 30 국문초록 3

Mobile Application Design to Vitalize Adoption of Abandoned Animals : Focused on Providing Observational Information of Animals at Abandoned Animal Shelter -

Recently, the elderly and single household, and social stress is increasing which also led to an increased interest of pets to alleviate loneliness and seek emotional stability. Due to such rising interest, the population of pets increased but the number of abandoned animals has also increased and such related social problems are arising as well. The percentage that abandoned animals become pets is also low, which has also become another problematic issue. Therefore, this study aims to suggest a plan to vitalize adoption. The research process includes finding the definition of an abandoned pet, examining a reality and status of adoption awareness for abandoned pets in addition to causes and problems of the abandonment through a literature investigation; the result shows the understanding and problems of abandoned pets. According to the Animal and Plant Quarantine Agency's investigation result on national consciousness of animal protection, adoption awareness towards abandoned pets had greatly increased with the opinion of agreement of 80.6%, which shows a positive awareness; however, according to the Ministry of Agriculture, Food and Rural Affair's investigation in 2014, the percentage that leads to an actual adoption was 31.4% and it was evident that there is a problem as the increasing trend has not been sustained because of a marginal rate every year. Through the investigation that examined the causes that hinder vitalizing adoptions, the conception of neglected animal makes the adoption itself more difficult and even if the adoption gets done, there are some situations of adoption dissolution. Thus, it is evident that a further study that can give trust in abandoned animals. Next, the investigation on local abandoned animal shelter's management status shows that most of the shelters do not have governmental support and have insufficient operation method and facilities. From a research on the current condition of operation of foreign abandoned animal's shelter, it was clear that the shelter runs from a systematic management and donation beyond a purpose of mere protection, and also found a opportunistic element on providing observational information. Moreover, by comparing the strength and weakness of the case studies from the similar services for the adoption of abandoned animals, local cases lack having detailed observational information, providing the information form in a perfunctory and fragmentary way, and showing a drastic discrepancy between the providers who actually give out the information; all of these are the make the adoption decision more difficult to be determined. Based on the literature research and case analysis, people who have experience on adopting abandoned animals, have intentions to adopt, or are interested but hesitant to adopt were interviewed to deduct the requirements. The interviews grasped the awareness and adoption experience of abandoned animals, and examined the abandoned animal adoption services and the usage experience of them along with the requirements. After that, the problems and requirements of the users were structuralized to provide an efficient search method by utilizing the affinity diagram, and draw out the goal of providing accurate observational information on supervised animals. Based on the interview, the participants were deducted into two groups from the behavioral pattern analysis of their action variables. Persona that belongs to each category of the two groups for each participant model was created; the first group is the type of 'providing detailed and accurate observational information on supervised animals to be more trustful' and the second group is the type of 'providing efficient searching.' Based on the behavior, problem and goal of these two personas, the way that the persona uses the application was concretely simulated with a situation scenario and the demands and improvements of personas were deducted finally. Based on this information, the study deducted 'trust+efficiency' as the keywords, defined the concept of the service and key functions of the 'Adopt Pet,' designed and proposed the structure of the mobile application and the wire frame, and created the prototype based on the given information to evaluate the usability assessment. The application was assessed on the satisfaction levels of service and adoption conditions; on the whole, it received a satisfactory evaluation. Finally, an improvement proposal offers to compensate the prototype that reflects the evaluation opinions of the participants. This study is likely to provide reliability for supervised animals, accuracy for observational information, and efficient information searching experience to people who are interested in adopting abandoned animals. Consequently, this study will hopefully come into as a foundation for vitalizing adoptions by providing observational information on abandoned animals.;최근 고령화 및 1인 가구의 증가, 사회적 스트레스 증가로 인한 외로움을 해소하고 정서적인 안정을 찾고자 반려동물에 대한 관심이 증가하고 있다. 이러한 관심의 증가로 인해 반려동물의 개체수가 증가하였지만 이와 동시에 유기동물의 개체 수 역시 증가하였고, 이로 인한 사회적인 문제가 발생하고 있다. 이렇게 증가한 유기동물이 실제 입양으로 연결되는 비율이 높지 않은 점 역시 문제라 할 수 있다. 따라서 본 연구는 입양활성화를 위한 방안을 제시하는데 목적이 있다. 연구 과정은 문헌조사를 통해 유기동물의 정의, 유기동물의 실태 및 입양 인식 현황, 유기의 원인 및 문제점을 조사하여 유기동물에 대한 이해와 문제점을 발견하였다. 농림수산검역검사본부의 2012년도 동물보호 국민의식 조사결과에 따르면 유기동물에 대한 입양 인식은 찬성의 의견이 무려 80.6%로 크게 증가한 것으로 나타나 긍정적인 인식을 가지고 있음을 알 수 있으나, 농림축산식품부의 2014년도 실태조사에 의하면 실제 입양으로 연결되는 비율은 31.4%로 매년 소폭으로 증가 추세가 유지되고 있음으로 문제가 있다는 것을 알 수 있었다. 이를 위해 입양이 활성화 되지 않고 있는 이유를 조사해본 결과, 버려진 동물이라는 인식 때문에 입양 자체가 힘들고 입양이 되더라도 후에 파양되는 경우가 있다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 유기동물에 대해 신뢰를 줄 수 있는 연구의 필요성이 있음을 알 수 있었다. 다음으로, 국내 유기동물보호소의 운영 현황 조사를 통해 정부지원이 없는 대다수의 사설보호소의 운영방식과 시설이 미흡함을 알 수 있었다. 해외 유기동물보호소의 운영현황 조사를 통해 단순한 보호가 아닌 체계적인 관리와 기부를 통해 운영하고 있음을 알 수 있었고, 관찰 정보 제공에 대한 기회요소를 발견하였다. 또한 유사 서비스 사례분석을 통해 유기동물의 입양을 위한 서비스들의 장·단점을 분석해본 결과 국내 사례에서는 자세한 관찰 정보 제공이 부족하며, 형식적이며 단편적인 정보형태로 제공하고 있었고, 정보를 실제로 제공하고 있는 사람들에 의한 내용의 편차가 심해 입양을 결심하기까지 어려운 것으로 분석되었다. 문헌조사와 사례분석의 내용을 바탕으로 유기동물을 입양 해봤거나, 유기동물을 입양할 의사가 있거나, 유기동물의 입양에 관심은 있으나 입양을 망설이고 있는 사람을 대상으로 요구사항 도출을 위해 인터뷰를 수행하였다. 유기동물에 대한 인식과 유기동물 입양 경험에 대해 파악하였고, 유기동물 입양 서비스의 이용 경험과 만족도를 조사하고 요구사항을 파악하였다. 그 후 어피니티 다이어그램을 활용해 사용자들의 문제점 및 요구사항을 구조화하여 효율적 탐색 제공, 신뢰할 수 있도록 관리 동물의 자세하고 정확한 관찰 정보 제공으로 목표를 도출할 수 있었다. 그 후 인터뷰 내용을 기반으로 하여 사용자들의 행동 변수를 통해 행동 패턴 분석으로 2개의 그룹으로 도출되었다. 이 2개 그룹의 유형에 해당하는 각각의 사용자 모델인 퍼소나를 제작하였으며, 1순위 퍼소나는 ‘신뢰할 수 있도록 관리 동물의 자세하고 정확한 관찰 정보 제공’ 유형이며, 2순위 퍼소나는 ‘효율적 탐색 제공’ 유형으로 제작되었다. 이 두 퍼소나의 행동과 문제점, 목표를 바탕으로 정황시나리오를 통해 퍼소나가 앱을 사용할 때 모습을 구체적으로 시뮬레이션하였고 최종적으로 퍼소나의 요구사항 및 개선방안을 도출하였다. 이를 바탕으로 ‘신뢰+효율’이라는 키워드를 도출하였으며 ‘Adopt Pet’ 서비스 컨셉과 주요 기능을 정의하였으며, 모바일 앱의 구조와 와이어프레임을 설계, 제안하였고 이를 기반으로 프로토타입을 제작해 사용성 평가를 진행하였다. 서비스 만족도, 입양 조건 만족도를 기준으로 평가하였고, 대체적으로 만족스럽다는 평가를 받았다. 최종적으로 참여자들의 평가 의견을 반영하여 프로토타입을 보완하고 개선안을 제안하였다. 본 연구는 유기동물 입양에 관심이 있는 사람들에게 관리 동물의 신뢰성과 관찰 정보의 정확성, 효율적인 정보 탐색을 경험하게 할 수 있을 것으로 예상된다. 이에 따라 유기동물의 관찰 정보 제공으로 입양 활성화를 위한 밑거름으로 작용할 수 있기를 기대한다.Ⅰ. 서론 1 A. 연구 배경 및 목적 1 B. 연구 내용과 방법 2 Ⅱ. 본론 5 A. 이론적 배경 및 사례 분석 5 1. 유기동물의 이해 5 2. 유기동물보호소 운영 현황 10 3. 유사 서비스 사례 분석 12 B. 사용자 조사 23 1. 사전 인터뷰 조사 24 2. 심층 인터뷰 계획수립 및 수행 26 3. 심층 인터뷰 내용 분석 28 4. 결과 분석 및 요구사항 도출 33 C. 디자인 설계 41 1. 디자인 목표 및 컨셉 42 2. 주요기능 정의 42 3. IA 설계 43 4. 와이어프레임 44 D. 프로토타입 평가 52 1. 프로토타입 평가 설계 및 수행 52 2. 결과 분석 53 3. 프로토타입 개선안 55 Ⅲ. 결론 및 제언 58 참고문헌 60 ABSTRACT 6