Production d’une activité amylolytique thermostable par Thermus thermophilus HB8 suivie du clonage et de l’expression d’une pullulanase de type 1 de T. thermophilus HB8 chez la levure méthylotrophe Pichia pastoris

Le besoin de développement d’amylases thermostables, principalement de pullulanases, s’est accru ces dernières décennies dû à l’importance de ces enzymes dans plusieurs bio-industries. Ce présent projet de recherche s’inscrit dans le cadre général du développement industriel de la production extracellulaire d’une pullulanase thermostable. Une revue bibliographique sur les avancées technologiques et les défis à relever pour la production extracellulaire de pullulanases thermostables a été réalisée. Cette revue de littérature expose une problématique liée à la production des pullulanases par divers hôtes d’origine et par le biais de production recombinante en utilisant des cellules hôtes comme E. coli, B. subtilis et P. pastoris. Cette problématique se résume dans la difficulté de produire de façon extracellulaire des pullulanases thermostables à haute activité enzymatique, ce qui engendre l’utilisation de plusieurs méthodes de purification coûteuses et souvent difficilement applicables à l’échelle industrielle. La modification structurale de ces enzymes via différentes techniques de protein engineering a permis le développement de pullullanases hautement thermostables et/ou ayant une activité catalytique remarquable. Cependant, ces techniques sont coûteuses et nécessitent le développement d’outils de bioinformatique plus efficaces afin de mieux maîtriser le processus de modification. Une étude expérimentale fut réalisée afin d’évaluer la capacité de Thermus thermophilus HB8 à accumuler de façon extracellulaire des enzymes amylolytiques, principalement de pullulanase. Les tests de production initiaux ont indiqué clairement que seulement de très faibles niveaux d'activité amylolytique pouvaient être détectés, à partir d’extraits cellulaires en utilisant le détergent doux non ionique Triton X-100 (TX100). Une stratégie d'optimisation séquentielle, basée sur des techniques statistiques, a été utilisée pour améliorer la production d'activité amylolytique extracellulaire afin d'obtenir des niveaux d’activité industriellement attrayants. L'accent a été mis sur le niveau optimal de la concentration initiale de la biomasse, la composition du milieu de culture et la température pour maximiser l'accumulation d'enzymes amylolytiques. Suite à de tels efforts, l'accumulation d'enzymes amylolytiques extracellulaires a été augmentée de plus de 70 fois, avec des niveaux d’activité de 76 U/mL. La préparation brute d'enzyme extracellulaire a été partiellement caractérisée. Les valeurs optimales de température et de pH ont été trouvées, respectivement, 80°C et 9,0. 100% de l'activité enzymatique initiale a pu être maintenu après 24 h d'incubation à 80°C, ce qui prouve la thermostabilité très élevée de la préparation enzymatique. Une autre étude sur la capacité de Pichia pastoris de produire de façon extracellulaire la pullulanase type 1 de Thermus thermophilus HB8 fut réalisée. Les effets de différents paramètres sur la production extracellulaire de la pullulanase ont été déterminés, à savoir les séquences peptides-signal de sécrétion (SP), la présence de Triton X-100 (TX100) à différentes concentrations et à différents temps d'addition, la présence de différents osmolytes naturels, le pH, la température et la source de carbone. La production de pullulanase extracellulaire a augmenté de plus de 40 fois en ajoutant de l'acide K-glutamique (0,40% (p/v)) avant 5 h d'induction, et du TX100 (2% (v/v)) après 48 h d'induction, et suivi d’une incubation de 24 h à 30°C et à pH de 8,0. Aussi les profils d’activité enzymatique de la pullulanase recombinante en fonction du pH et de la température furent établis. La température et le pH optimaux de l'activité pullulanase étaient respectivement, 70°C et 6,0. La préparation enzymatique a maintenu 50% de son activité catalytique après une incubation à 70°C pendant plus de 120 min

Extending the vibroscape to agroecosystems: investigating the influence of abiotic factors and monitoring insect vibrational signaling

Environmental conditions are crucial factors that influence communication systems and affect animal behavior. Research in the field of biotremology has improved our understanding of insect behavior, ecology, and evolution. However, the interactions between vibrational signaling and environmental factors are less studied, mainly because of technical issues faced in field trials. We therefore developed and tested an approach to investigate the effect of abiotic factors on insect vibrational signaling and explored its implementation as a monitoring tool for insect vibrational signals, using a vineyard as an agroecosystem model. Our results showed a significant decrease in insect signaling activity during unsuitable conditions of high temperature and wind velocity. We determined for the first time, the daily signaling pattern of the two insect pests, Scaphoideus titanus and Halyomorpha halys, in natural conditions. Biotremology techniques could be profitably used to monitor not only the presence of target pest species but also the biodiversity associated with vibrational signaling insects. In particular, the method implemented in this study could be used as a tool to compare the quality of cultivated areas under different management system

Intrasexual vibrational behavior of Philaenus spumarius in semi-field conditions

Insects that communicate by vibrational signals live in a complex interactive network of communication. Most studies on insect intrasexual behavior, based on plant-borne vibrational signals, have targeted few individuals. Despite their importance, behaviors that occur within groups were often overlooked. The study of multiple individuals, when insects occur in high density could simulate the environment in which they live and provide more reliable information on their behavior. In semi-field conditions, we investigated the intrasexual behavior of the meadow spittlebug, Philaenus spumarius. Vibrational signals exchanged among individuals of the same sex were recorded throughout their adult stage, from late spring to early autumn, and during the day, from the morning to the evening using a laser vibrometer. Males were less active than females throughout the season and their interactions were less frequent compared to females. Intrasexual interactions were characterized by signal overlapping in both unisex groups, in addition to signal alternating only in the case of males. In conclusion, the study of signaling behavior in intrasexual groups contributed to a better understanding of P. spumarius social behavior. We discuss the hypothesis of a possible competitive behavior between males and cooperative behavior between female

Vibrational mating disruption against insect pests: five years of experimentation in the vineyard

The use of vibrational signals in agriculture is becoming an important research topic as a new method of behavioural manipulation of insect pests. Semiophysicals include mechanical signals that have the potential to become environmentally friendly alternatives to pesticides. Like pheromones, vibrations endowed with specific spectral and temporal characteristics, can interfere with the mating behaviour of pests, thus preventing population outbreaks and crop damage. This approach is called "vibrational mating disruption" (VMD) and can be applied to control leafhoppers, insects that rely almost exclusively on vibrational signals for mating. Laboratory and semi-field tests have demonstrated that a species-specific mechanical stimulus transmitted to a plant (i.e., grapevine) by means of mini-shakers, can cause the total interruption of mating. In the present contribution, we report the results of a long-term research conducted on two target species, the leafhoppers Scaphoideus titanus and Hebata vitis. Since 2017 a field-scale experiment has been launched by setting up the first world 'vibrational vineyard' in the Trentino region (Italy) to evaluate the VMD efficacy. Every summer, the population density of the two insects has been measured by visual counting of the nymphs on leaves and yellow sticky traps for the adults. The efficiency of the actuator prototypes was monitored using highly sensitive equipment (laser Doppler vibrometer and accelerometers) and the transmission of vibrations in the trellis system was evaluated with a numerical model of the vineyard. Overall, the vibrational mating disruption technique proved to be effective in reducing the population density of both S. titanus and H. vitis as long as the disruptive signal was transmitted on the leaves above an active threshold of ca. 15 μm/s of amplitude. The use of vibrations to control pests in vineyards seems to be a promising innovation. Next step will be the application of the method on large vine surface

The Early Phases of Ankylosing Spondylitis: Emerging Insights From Clinical and Basic Science

In our paper, we discuss how the early phases of ankylosing spondylitis (AS) are linked to peri-firbocartilagenous osteitis in the sacroiliac joint and entheseal bone related anchoring sites. This skeletal proclivity is linked to an abnormal immunological response to skeletal biomechanical stress and associated microdamage. A key event in the early stages of AS appears to be the association with subclinical Crohn's-like colitis with this gut inflammation being pivotal to the osteitis reaction. Whether this osteitis is consequent to non-specific intestinal innate immune activation or adaptive immune responses against specific microbiotal or self-antigens is unknown. Recurrent iritis is an HLA-B27 associated feature that may predate AS and pursues a course independent of joint involvement, and points toward the pivotal role of organ specific immunology over generalized systemic immune responses in disease expression. Human genetics and animal model studies strongly incriminate the IL23/17 axis and TNF-α in disease pathogenesis. Preliminary work shows a strong convergence of innate immune cells including type 3 innate lymphoid-cells (ILC3) and γδ T-cells in skin, gut, entheseal, and eye inflammation. Despite the HLA-B27 association, the role of adaptive immunity, especially CD8+ T-cells mediated responses remains unproven and alternative theories have been proposed. The emerging non-dependence of axial inflammation on IL-23 but dependence on IL-17A is an unexpected new twist that awaits full explanation. In this mini-review, we discuss the key events in the early stages of human AS from clinical and basic science aspects, which could be crucial for attempted disease prevention studies in at risk subjects

Production d’une activité amylolytique thermostable par Thermus thermophilus HB8 suivie du clonage et de l’expression d’une pullulanase de type 1 de T. thermophilus HB8 chez la levure méthylotrophe Pichia pastoris

Le besoin de développement d’amylases thermostables, principalement de pullulanases, s’est accru ces dernières décennies dû à l’importance de ces enzymes dans plusieurs bio-industries. Ce présent projet de recherche s’inscrit dans le cadre général du développement industriel de la production extracellulaire d’une pullulanase thermostable. Une revue bibliographique sur les avancées technologiques et les défis à relever pour la production extracellulaire de pullulanases thermostables a été réalisée. Cette revue de littérature expose une problématique liée à la production des pullulanases par divers hôtes d’origine et par le biais de production recombinante en utilisant des cellules hôtes comme E. coli, B. subtilis et P. pastoris. Cette problématique se résume dans la difficulté de produire de façon extracellulaire des pullulanases thermostables à haute activité enzymatique, ce qui engendre l’utilisation de plusieurs méthodes de purification coûteuses et souvent difficilement applicables à l’échelle industrielle. La modification structurale de ces enzymes via différentes techniques de protein engineering a permis le développement de pullullanases hautement thermostables et/ou ayant une activité catalytique remarquable. Cependant, ces techniques sont coûteuses et nécessitent le développement d’outils de bioinformatique plus efficaces afin de mieux maîtriser le processus de modification. Une étude expérimentale fut réalisée afin d’évaluer la capacité de Thermus thermophilus HB8 à accumuler de façon extracellulaire des enzymes amylolytiques, principalement de pullulanase. Les tests de production initiaux ont indiqué clairement que seulement de très faibles niveaux d'activité amylolytique pouvaient être détectés, à partir d’extraits cellulaires en utilisant le détergent doux non ionique Triton X-100 (TX100). Une stratégie d'optimisation séquentielle, basée sur des techniques statistiques, a été utilisée pour améliorer la production d'activité amylolytique extracellulaire afin d'obtenir des niveaux d’activité industriellement attrayants. L'accent a été mis sur le niveau optimal de la concentration initiale de la biomasse, la composition du milieu de culture et la température pour maximiser l'accumulation d'enzymes amylolytiques. Suite à de tels efforts, l'accumulation d'enzymes amylolytiques extracellulaires a été augmentée de plus de 70 fois, avec des niveaux d’activité de 76 U/mL. La préparation brute d'enzyme extracellulaire a été partiellement caractérisée. Les valeurs optimales de température et de pH ont été trouvées, respectivement, 80°C et 9,0. 100% de l'activité enzymatique initiale a pu être maintenu après 24 h d'incubation à 80°C, ce qui prouve la thermostabilité très élevée de la préparation enzymatique. Une autre étude sur la capacité de Pichia pastoris de produire de façon extracellulaire la pullulanase type 1 de Thermus thermophilus HB8 fut réalisée. Les effets de différents paramètres sur la production extracellulaire de la pullulanase ont été déterminés, à savoir les séquences peptides-signal de sécrétion (SP), la présence de Triton X-100 (TX100) à différentes concentrations et à différents temps d'addition, la présence de différents osmolytes naturels, le pH, la température et la source de carbone. La production de pullulanase extracellulaire a augmenté de plus de 40 fois en ajoutant de l'acide K-glutamique (0,40% (p/v)) avant 5 h d'induction, et du TX100 (2% (v/v)) après 48 h d'induction, et suivi d’une incubation de 24 h à 30°C et à pH de 8,0. Aussi les profils d’activité enzymatique de la pullulanase recombinante en fonction du pH et de la température furent établis. La température et le pH optimaux de l'activité pullulanase étaient respectivement, 70°C et 6,0. La préparation enzymatique a maintenu 50% de son activité catalytique après une incubation à 70°C pendant plus de 120 min

Does HLA-B27 Status Influence Ankylosing Spondylitis Phenotype?

The association of HLA-B27 with ankylosing spondylitis (AS) remains as one of the intriguing models that could exist between a molecule and human disease in medicine. Although it was reported in 1973, its contribution to AS and related spondyloarthritis continues to be a major challenge for scientific community. It is important to understand its etiopathogenic mechanism and its functions in these diseases. Although the diagnostic and prognostic roles of HLA-B27 in AS are still debated, there is an increasing interest for HLA-B27–based effects especially in HLA-B27(+) patients with AS. This review will focus in the examination of published reports regarding the influence of HLA-B27 status on the demographic and clinical features in AS, with specific interest to its role on AS severity