Strukturelle und immunologische Charakterisierung der Spinnenseide von Nephila clavipes

Ziel der Arbeit war es, die Spinnenseide des Sicherungsfadens der Goldenen Radnetzspinne Nephila clavipes zu charakterisieren und eventuelle Zusammenhänge zwischen Fadenbildung, strukturellem Aufbau und biochemischer Konsistenz herauszuarbeiten. Dabei war vor allem die noch weitgehend unverstandene Rolle der beiden bekannten Spidroine MASp1 und MASp2 sowie ihrer repetitiven und konservierten C-terminalen Domänen von Interesse. Hierzu wurden Antiseren gegen rekombinante Polypeptide mit den entsprechenden Sequenzen aus beiden Bereichen der beiden Gene hergestellt, affinitätsgereinigt und in den biochemischen und histochemischen Untersuchungen eingesetzt. Mithilfe der Antikörper konnte erstmalig gezeigt werden, dass die hochkonservierten C-Termini auch in den hochmolekularen Proteinfraktionen der ausgesponnenen Fäden wieder zu finden sind und nicht etwa vor der Fadenbildung abgespalten werden. Experimente zeigten, dass Sie zur Bildung von Disulfidbrücken befähigt sind. Ihre Bedeutung sowie ihre phylogenetische Entwicklung wird im Zusammenhang mit Ergebnissen aus Sequenzvergleichen diskutiert. Aus den biochemischen Untersuchungen des Spinnguts ergab sich, dass dies überraschend heterogen ist und mehrere hochmolekulare, lösliche Proteine im Bereich von 220-270 kDa aufweist. Durch Anfärbung mit Lektinen wurde gezeigt, dass die Spidroine aller Wahrscheinlichkeit nach O-glycosyliert sind. Als weitere Ursache für die Heterogenität wurden N-terminale Abbauprozesse diskutiert, die sich aus den mit den Antiseren erzielten Ergebnissen und Versuchen N-terminaler Sequenzierung ergaben. Die Ergebnisse der strukturellen und der immunologischen Studien wurden in einem Modell zum Aufbau der Tragfäden von Nephila clavipes zusammengefasst. Neben einem Kern besitzt die Seide eine aus drei Schichten bestehende Hülle. Während die beiden äußeren Schichten labil sind, zeigt die dritte innere Schicht eine hohe Resistenz gegen Laugen, Säuren und chaotrope Agenzien und verleiht dem Faden Stabilität. Der Kern lässt sich aufgrund der Verteilung der Spidroine in zwei Zonen unterteilen. Während MASp1homogen verteilt in beiden Zonen vorliegt, fehlt MASp2 in der äußeren Zone und liegt in der inneren Zone konzentriert in kleinen Inseln vor. Dieses Verteilungsmuster wird im Zusammenhang mit der Rolle von MASp2 bei der Fadenbildung und dem Auftreten von Fibrillen diskutiert

Composition and Hierarchical Organisation of a Spider Silk

Albeit silks are fairly well understood on a molecular level, their hierarchical organisation and the full complexity of constituents in the spun fibre remain poorly defined. Here we link morphological defined structural elements in dragline silk of Nephila clavipes to their biochemical composition and physicochemical properties. Five layers of different make-ups could be distinguished. Of these only the two core layers contained the known silk proteins, but all can vitally contribute to the mechanical performance or properties of the silk fibre. Understanding the composite nature of silk and its supra-molecular organisation will open avenues in the production of high performance fibres based on artificially spun silk material

Biochemical composition of outer layers.

<p>Panel A. Oil red staining of fibres. Silk fibres were treated with water (upper filament) or ether extracted (lower filament) followed by oil red staining. Bar corresponds to 2000 nm. Panel B. Concavalin A (Con A) staining of fibres. Fibres gently washed in phosphate buffered saline or vigorously washed in 0.1% Triton X-100 were reacted with biotinylated Con A. The presence of α-methyl mannoside (α-MM), an inhibitor of Con A, is indicated by “I”. Bound Con A was visualised by gold conjugated streptavidin and SEM. The bar equals 500 nm.</p

Spatial image microscopy of fibrillar structures.

<p>Panel A. Cut end of a dragline incubated in 8 M urea. High resolution stereo image was acquired with a Zeiss Neofluar 100x/NA 1.3 oil immersion objective. A stereo lorgnette is required for obtaining the 3D effect. The upper arrows will appear as one arrow behind the object, whereas the lower arrow in the right picture will appear in front of it. They indicate the end of the conical shape pointing to the open ends. Fibrils can be seen in the central parts (lower arrow, left image) of the fibre. Panel B. Freeze fractured dragline incubated in 8 M urea. Image was acquired as in panel A. The fractured site is indicated by the lower arrows. The exposed interior shows that the fibre consists of many fibrils, which are twisted (upper arrow) and from bundles.</p

Cross sections of dragline from the spider <i>Nephila clavipes</i>.

<p>Panel A. TEM micrographs. The core, skin and glyco layers are indicated. The inset shows the presence of a lipid layer detached from the rest of the fibre. Bar corresponds to 100 nm. Panel B. AFM micrographs. The arrows indicate some of the cavities. The core, skin, glyco layers and an artificial halo are indicated. Lack of symmetry in the latter indicates that the halo is caused by the sectioning procedure and reflects material compressed and displaced by the knife as it approaches the hard skin layer. The bar corresponds to 500 nm. The height colour coding bar extends bottom to top from 0 to 100 nm. Panel C. Attachment strength of silk layers. Untreated fibres were successively ether extracted, vigorously washed in 0.1% Triton X-100 detergent solution and subjected to freeze-thaw cycles. After treatment cross-sections of fibres for each step were analyzed by TEM. The loss of layers from outside to inside is evident. The efficiencies for removal lipids, glycoproteins and the skin were 100%, 70% and 30%, respectively. The bar corresponds to 200 nm.</p

Treatment of fibres with chaotropic agents and acids.

<p>Panel A. Light Microscopy (LM) phase images of fibres treated with mixtures of different ratios between HAc and HCl. Bar corresponds to 4000 nm. Minor (mi, reinforcement) and major (ma, dragline) ampullate fibres are indicated. Panel B. Light Microscopy (LM) phase contrast images of dragline treated with LiSCN at the stated concentrations for 1 minute. Bar corresponds to 8000 nm. Panel C. Scanning Electron Microscope (SEM) images of dragline incubated for the indicated times with 99% Hfip. Bar corresponds to 1000 nm. Panel D. Video contrast images of draglines (left unstressed, right fractured by applying stress) soaked in 8 M urea and counterstained with Coomassie Brilliant Blue. Bar equals 4000 nm.</p

Compositions and functions of silk layers from the dragline of <i>N. clavipes</i>

<p>MiSp: minor ampullate spidroin; MaSp: major ampullate spidroin</p