Transgressive phenotypes and generalist pollination in the floral evolution of Nicotiana polyploids

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Functional consequences of natural and synthetic polyploidization of Nicotiana attenuata and N. obtusifolia- special focus on expressed anti-herbivore response

Polyploidie ist ein häufiges Phänomen im Pflanzenreich. Geschätzte 30 bis 80% der bekannten Arten sind polyploid (Meyers and Levin, 2006; Rieseberg and Willis 2007). Desweiteren haben auch Duplikationen einzelner Chromosomen die Evolution diploider Spezies beeinflusst (Sidow 1996; Kellis et al. 2004). Eine beträchtliche Anzahl an Pflanzen, die als klassische diploide Arten galten, wie z.B. Arabidopsis und Mais, werden heute als ursprünglich polyploid betrachtet (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000; Wolfe, 2001; Cui et al., 2006). Jüngste Ergebnisse deuten darauf hin, dass Polyploidie zu Änderungen in der Genexpression führen kann (durch Gen-Dosis-Effekte, Beeinflussung regulatorischer Wechselwirkungen und durch genetische und epigenetische Veränderungen), was oft zu neuen phänotypischen Variationen führt und eine Anpassung an ein breites Habitatsspektrum und an ungünstige Umgebungsbedingungen erlaubt. Diese phänotypische Vielfalt verleiht polyploiden Organismen evolutionäre und ökologische Vorteile gegenüber ihren Elternspezies. Die Gattung Nicotiana bietet viele Vorteile für die Untersuchung von Polyploidie, nicht nur wegen des gut beschriebenen phylogenetischen Stammbaums [die Gattung umfaßt 75 Arten von denen 35 als allopolyploid beschrieben sind (Chase et al., 2003; Clarkson et al., 2004)] sondern auch wegen ihrer umfassend untersuchten Ökologie. N. quadrivalvis (Nq) und N. clevelandii (Nc) sind allopolyploide Arten, die durch Amphidiploidie aus den zwei diploiden Vorfahren N. attenuata (Vater) und N. obtusifolia (Mutter) vor etwa zwei Mio. Jahren entstanden sind (Chase et al., 2003). Nq und Nc wurden bereits in mehreren Studien verwendet um den Einfluß von Polyploidie auf die Evolution polygener Verteidungsstrategien (Lou and Baldwin, 2003; Qu et al., 2004; Wu et al., 2006) und auf Veränderungen der Genomgröße zu untersuchen (Leitch et al.,2008). Dabei kamen die Autoren zu dem Schluss, dass die Evolution von Nq und Nc mit einer Vergrößerung des Genoms von 2.5 bzw. 7.5% und einer massiven Umgestaltung der elterlichen polygenetischen Verteidigungsmechanismen einherging (die spezifische Signalantwort von Na auf bestimmte Herbivoren wurde in abgeänderter Form in Nq erhalten, während sie in Nc größtenteils verloren ging; das väterliche TPI-Gen hingegen ging sowohl in Nq als auch in Nc verloren). Ob diese Veränderungen jedoch direkt nach der Polyploidisierung oder erst im Verlauf der folgenden zwei Mio. Jahre aufgetreten waren blieb ungewiß. Aus diesem Grund simulierten wir die Allopolyploidie von Nc und Nq durch die Herstellung synthetischer polyploider Linien: der allotetraploiden N. ×obtusiata (N ×o) [N. attenuata (Na) (als Vater) × N. obtusifolia (No) (als Mutter)] und der jeweils autotetraploiden Nachkommen von Na (NaT) und No (NoT). Im ersten Teil meiner Arbeit (Kapitel I) untersuchten wir die genetischen, genomischen und phänotypischen Veränderungen der synthetischen auto- und allopolyploiden im Vergleich zu den diploiden Elternarten (Na und No) und den natürlichen Allotetraploiden Nq und Nc. DNA-„Fingerabdruck“-Profile (durch UP-PCR) ergaben, dass die fünf N×o-Linien ähnliche aber nicht identische Profile aufwiesen. Synthetische und natürliche Polyploidie hatte einen Dosis-abhängigen Effekt auf die Genomgröße (gemessen in den Samen), wobei allerdings nur Nq mit der Genomvergrößerung in Beziehung stand. Analysen auf zellulärer Ebene ergaben, dass die N×o -Linien intermediäre Phänotypen ihrer Elternspezies aufwiesen. Sowohl Allo- als auch Autotetraploidisierung hatten einen Dosis-Effekt auf Samenmasse und Trockenbiomasse (außer bei NaT), allerdings hatten sie keinen Einfluß auf die Stammhöhe zur Zeit der ersten Blüte. Nc wies väterliche (Na) zelluläre Phänotypen auf aber vererbte mütterliche (No) Biomasse und Samenmasse, während hingegen Nq mütterliche (No) zelluläre Phänotypen aber vererbte väterliche (Na) Muster von Biomasse und Samenmasse zeigte. In einer Hauptkomponenten-Analyse gruppierte Nq aufgrund der ähnlichen Samenmasse, der Stammlänge und der Genomgröße mit den N×o -Linien. Dieselben Eigenschaften unterschieden Nc, No und Na von Nq und den N×o -Linien, wobei die Biomasse Na von N×o - und den Nq-Linien trennte und NaT näher mit Nq und den N×o -Linien gruppierte als mit Na. In diesem Kapitel konnten wir zeigen, dass sowohl Allo- als auch Autotetraploidie beträchtliche morphologische, genetische und genomische Veränderungen hervorrufen, von denen viele zumindest in einer der natürlichen Polyploiden Arten erhalten wurden. Wir betrachten daher sowohl natürliche als auch synthetische Polyploide als gut geeignet um die Evolution adaptiver Merkmale zu untersuchen. Im zweiten Teil meiner Arbeit (Kapitel II) untersuchten wir die Expression Herbivorie-induzierter Gene von Na und No in den synthetischen Auto- und Allopolyploiden um allgemein zu verstehen wie die Expression von Genen, die komplexe polygene Merkmale regulieren, durch Polyploidisierung beeinflußt wird. Die Applikation oraler Sekrete (OS) von Manduca sexta auf mechanisch verwundete Blätter von Na führt u.a. zu einer schnellen Akkumulation von Transkripten der Gene „wound-induced protein kinase” (WIPK), „lipoxygenase 3“ (LOX3), „non-expressor of pathogenesis-related 1“ (NPR1) und „jasmonate-resistant 4“ (JAR4). Diese transkriptionelle Antwort korreliert mit einer Akkumulation von Jasmonsäure (JA), Jasmonsäure-Isoleucin (JA-Ile) und Trypsin-Protease-Inhibitoren (TPIs). In No hingegen reduzierten die oralen Sekrete NPR1-Transkripte und erhöhten die Mengen an Salicylsäure (SA), welche der Wirkung von JA und der JA-abhängigen Verteidigung entgegenzuwirken schien. OS-induzierte N×o-Linien produzierten große Mengen der uniparentalen Transkripte Na-WIPK, No-LOX3, No-JAR4 und Na-TPI aber nur geringe Mengen von Na- und No-NPR1. Na- und No-NPR1 Transkripte korrelierten mit einer Zunahme von SA und einer Abnahme von JA, was erneut auf einen SA/JA-Antagonismus in den allopolyploiden Kreuzungen hinweist. Eine Behandlung der N×o-Linien mit Methyljasmonat induzierte die Transkripte von LOX3, JAR4 und TPI von beiden Eltern in ähnlichem Ausmaß, was darauf hindeutet, dass das beobachtete uniparentale Expressionsmuster nach OS-Induktion nicht auf eine spezifische Inaktivierung von Genen zurückzuführen ist. Bezüglich der TPI-Aktivität entsprachen die N×o-Linien 1 und 2 Na, während die Linien 3 bis 5 eher mit No vergleichbar waren. Dies legt nahe, dass synthetische Neo-Allopolyploide die Expression der elterlichen und für die Verteidigung relevanten Gene rasch neu anpassen um diverse Verteidigungsantworten gegen Herbivoren hervorzubringen. Wir folgern daraus, dass solche Expressionsänderungen von Genen mit Schlüsselfunktionen und post-transkriptionelle Vorgänge eine adaptive Radiation während der allopolyploiden Artbildung begünstigen

Variation in Antiherbivore Defense Responses in Synthetic Nicotiana Allopolyploids Correlates with Changes in Uniparental Patterns of Gene Expression1[W][OA]

We examined the expression of Nicotiana attenuata (Na) and Nicotiana obtusifolia (No) herbivore-induced genes in synthetic autopolyploids (NaT and NoT) and five independent allopolyploid Nicotiana × obtusiata (N×o) lines to understand how the expression of genes regulating complex polygenetic defense traits is altered in the early stages of allopolyploid hybridization. In Na, applying Manduca sexta oral secretions (OS) to wounds rapidly increased the transcript accumulation of wound-induced protein kinase (WIPK), lipoxygenase 3 (LOX3), nonexpressor of pathogenesis-related 1 (NPR1), and jasmonate-resistant 4 (JAR4) genes; these were correlated with increases in accumulation of jasmonic acid (JA), jasmonate-isoleucine, and trypsin protease inhibitors (TPIs). In No, OS elicitation reduced NPR1 transcripts and increased the level of salicylic acid (SA) that appeared to antagonize JA and JA-mediated defenses. OS elicited N×o lines, accumulated high levels of the uniparental transcript of WIPK, LOX3, JAR4, and TPI, but low levels of both parental NPR1 transcripts that in turn were correlated with an increase in SA and a decrease in JA levels, suggesting SA/JA antagonism in the allopolyploid crosses. Methyl jasmonate treatment of N×o lines elicited transcripts of both parental LOX3, JAR4, and TPIs, demonstrating that the uniparental pattern observed after OS elicitation was not due to gene inactivation. TPIs were induced at different levels among N×o lines; some lines expressed high levels comparable to Na, others low levels similar to No, suggesting that synthetic neoallopolyploids rapidly readjust the expression of their parental defensive genes to generate diverse antiherbivore responses. Changes in the expression of key genes and posttranscriptional events likely facilitate adaptive radiations during allopolyploid speciation events

Characteristics of ciprofloxacin-resistant enterobacteriaceae isolates recovered from wastewater of an Algerian hospital

Introduction: Hospital effluents are a source of environmental pollution by drugs, antibiotic-resistant bacteria, and resistance genes. Quinolones, particularly ciprofloxacin, are commonly detected in these effluents, contributing to the emergence of antimicrobial resistance. The objective of this study was to characterize ciprofloxacin-resistant Enterobacteriaceae in hospital effluents. Methodology: Isolates were selected on Tergitol-7 agar supplemented with ciprofloxacin and genotyped by ERIC-PCR. Antibiotic susceptibility testing was done using the disk diffusion method, and minimum inhibitory concentrations were determined using the agar dilution method. Resistance genes, integrons, phylogenetic groups, and sequence types were identified by PCR and sequencing. Results: A total of 17 ciprofloxacin-resistant isolates were characterized: Escherichia coli, Escherichia vulneris, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Citrobacter freundii, and Citrobacter koseri/farmeri. Isolates presented concomitant resistance to nalidixic acid, ciprofloxacin, ofloxacin, and pefloxacin. A diversity in mutation patterns in gyrA and parC genes and new amino-acid substitutions in GyrA subunit were observed. Quinolone plasmidic resistance genes qnrB1, qnrB2, qnrB5/19, qnrS1, and aac(6)-Ib-cr were detected. Resistance to other antibiotic classes was observed. Class 1 integrons and resistance genes blaCTX-M-15, blaOXA-1, sul1, sul2, sul3, tetA, tetB, aadA1/2, aadA5, aph(3)-Ia, aac(3)II, dfrA1, dfrA5, dfrA7, and dfrA12 were detected. Bacterial tolerance to cadmium, zinc, and mercury was observed with the presence of the merA gene. E. coli isolates belonged to phylogenetic groups A, B1, and D and to sequence types ST405, ST443, ST101, ST10, and ST347. Conclusions: This study highlighted bacterial multidrug resistance linked to ciprofloxacin and, consequently, the risk of bacterial exposure to this antibiotic. © 2016 Anssour et al

The promise of genomics in the study of plant-pollinator interactions

Flowers exist in exceedingly complex fitness landscapes, in which subtle variation in each trait can affect the pollinators, herbivores and pleiotropically linked traits in other plant tissues. A whole-genome approach to flower evolution will help our understanding of plant-pollinator interactions

Phenotypic, genetic and genomic consequences of natural and synthetic polyploidization of Nicotiana attenuata and Nicotiana obtusifolia

BACKGROUND AND METHODS: Polyploidy results in genetic turmoil, much of which is associated with new phenotypes that result in speciation. Five independent lines of synthetic allotetraploid N. × obtusiata (N × o) were created from crosses between the diploid N. attenuata (Na) (♂) and N. obtusifolia (No) (♀) and the autotetraploids of Na (NaT) and No (NoT) were synthesized. Their genetic, genomic and phenotypic changes were then compared with those of the parental diploid species (Na and No) as well as to the natural allotetraploids, N. quadrivalvis (Nq) and N. clevelandii (Nc), which formed 1 million years ago from crosses between ancient Na and No. KEY RESULTS: DNA fingerprinting profiles (by UP-PCR) revealed that the five N × o lines shared similar but not identical profiles. Both synthetic and natural polyploidy showed a dosage effect on genome size (as measured in seeds); however, only Nq was associated with a genome upsizing. Phenotypic analysis revealed that at the cellular level, N × o lines had phenotypes intermediate of the parental phenotypes. Both allo- and autotetraploidization had a dosage effect on seed and dry biomass (except for NaT), but not on stalk height at first flower. Nc showed paternal (Na) cellular phenotypes but inherited maternal (No) biomass and seed mass, whereas Nq showed maternal (No) cellular phenotypes but inherited paternal (Na) biomass and seed mass patterns. Principal component analysis grouped Nq with N × o lines, due to similar seed mass, stalk height and genome size. These traits separated Nc, No and Na from Nq and N × o lines, whereas biomass distinguished Na from N × o and Nq lines, and NaT clustered closer to Nq and N × o lines than to Na. CONCLUSIONS: Both allo- and autotetraploidy induce considerable morphological, genetic and genomic changes, many of which are retained by at least one of the natural polyploids. It is proposed that both natural and synthetic polyploids are well suited for studying the evolution of adaptive responses

Silencing NaTPI Expression Increases Nectar Germin, Nectarins, and Hydrogen Peroxide Levels and Inhibits Nectar Removal from Plants in Nature1[W][OA]

Native flower visitors removed less nectar from trypsin proteinase inhibitor (TPI)-silenced Nicotiana attenuata plants (ir-pi) than from wild-type plants in four field seasons of releases, even when the nectar repellant, nicotine, was also silenced. Analysis of floral chemistry revealed no differences in the emission of the floral attractants benzylacetone and benzaldehyde or in the concentrations of nectar sugar and nicotine between wild-type and ir-pi flowers, suggesting that these two lines are equally able to attract insect visitors. TPI activity was found in all wild-type flower parts and was highest in anther heads, while TPI activity was not found in any parts of ir-pi flowers. The nectar of ir-pi flowers contained 3.6-fold more total proteins than the nectar of wild-type flowers. Proteomics analysis and hydrogen peroxide (H2O2) measurements revealed that ir-pi nectar contained more nectarins and nectar germin-like proteins and about 1.5-fold more H2O2 compared with wild-type nectar. Field experiments with wild-type flowers supplemented with a solution containing sugar and glucose oxidase demonstrated a causal association between the accumulation of H2O2 and the reduction in nectar removal. These results showed that silencing TPI expression increases the accumulation of nectar proteins and H2O2 levels, which in turn reduces nectar removal by native insect floral visitors. The effect of silencing TPIs on nectar protein accumulation suggests an endogenous regulatory function for TPIs in N. attenuata flowers. The repellency of H2O2 to floral visitors raises new questions about the qualities of nectar that make it attractive for pollinators