Oblique circle method for measuring the curvature and twist of mitotic spindle microtubule bundles

The highly ordered spatial organization of microtubule bundles in the mitotic spindle is crucial for its proper functioning. The recent discovery of twisted shapes of microtubule bundles and spindle chirality suggests that the bundles extend along curved paths in three dimensions, rather than being confined to a plane. This, in turn, implies that rotational forces, i.e., torques, exist in the spindle in addition to the widely studied linear forces. However, studies of spindle architecture and forces are impeded by a lack of a robust method for the geometric quantification of microtubule bundles in the spindle. In this work, we describe a simple method for measuring and evaluating the shapes of microtubule bundles by characterizing them in terms of their curvature and twist. By using confocal microscopy, we obtain three-dimensional images of spindles, which allows us to trace the entire microtubule bundle. For each traced bundle, we first fit a plane and then fit a circle lying in that plane. With this robust method, we extract the curvature and twist, which represent the geometric information characteristic for each bundle. As the bundle shapes reflect the forces within them, this method is valuable for the understanding of forces that act on chromosomes during mitosis

The chirality of the mitotic spindle provides a mechanical response to forces and depends on microtubule motors and augmin

Forces produced by motor proteins and microtubule dynamics within the mitotic spindle are crucial for proper chromosome segregation. In addition to linear forces, rotational forces or torques are present in the spindle, which are reflected in the left-handed twisted shapes of microtubule bundles that make the spindle chiral. However, the biological role and molecular origins of spindle chirality are unknown. By developing methods for measuring the spindle twist, we show that spindles are most chiral near the metaphase-to-anaphase transition. To assess the role of chirality in spindle mechanics, we compressed the spindles along their axis. This resulted in a stronger left-handed twist, suggesting that the twisted shape allows for a mechanical response to forces. Inhibition or depletion of motor proteins that perform chiral stepping, Eg5/kinesin-5, Kif18A/kinesin-8, MKLP1/kinesin-6, and dynein, decreased the left-handed twist or led to right- handed twist, implying that these motors regulate the twist by rotating microtubules within their antiparallel overlaps or at the spindle pole. A right-handed twist was also observed after the depletion of the microtubule nucleator augmin, indicating its contribution to the twist through the nucleation of antiparallel bridging microtubules. The uncovered switch from left- handed to right-handed twist reveals the existence of competing mechanisms that promote twisting in opposite directions. As round spindles are more twisted than the elongated ones are, we infer that bending and twisting moments are generated by similar molecular mechanisms and propose a physiological role for spindle chirality in allowing the spindle to absorb mechanical load

Naegleria’s mitotic spindles are built from unique tubulins and highlight core spindle features

Naegleria gruberi is a unicellular eukaryote whose evolutionary distance from animals and fungi has made it useful for developing hypotheses about the last common eukaryotic ancestor. Naegleria amoebae lack a cytoplasmic microtubule cytoskeleton and assemble microtubules only during mitosis and thus represent a unique system for studying the evolution and functional specificity of mitotic tubulins and the spindles they assemble. Previous studies show that Naegleria amoebae express a divergent α-tubulin during mitosis, and we now show that Naegleria amoebae express a second mitotic α- and two mitotic β-tubulins. The mitotic tubulins are evolutionarily divergent relative to typical α- and β-tubulins and contain residues that suggest distinct microtubule properties. These distinct residues are conserved in mitotic tubulin homologs of the “brain-eating amoeba” Naegleria fowleri, making them potential drug targets. Using quantitative light microscopy, we find that Naegleria’s mitotic spindle is a distinctive barrel-like structure built from a ring of microtubule bundles. Similar to those of other species, Naegleria’s spindle is twisted, and its length increases during mitosis, suggesting that these aspects of mitosis are ancestral features. Because bundle numbers change during metaphase, we hypothesize that the initial bundles represent kinetochore fibers and secondary bundles function as bridging fibers

Ravnoteža sila i momenata sila u diobenom vretenu

In this thesis, I present results of my work over the last three years, carried out as a member of Pavin Group at the Faculty of Science, University of Zagreb. The mitotic spindle is a complex micro-machine composed of microtubules and associated proteins that must be highly ordered in space and time to function properly. A functional spindle has a distinct shape composed of curved bundles of microtubules twisted around the pole-to-pole axis. There is still a lack of understanding of how linear and rotational forces define the overall shape of the mitotic spindle, as well as how twisted shapes emerge as a result of interactions between microtubules and motor proteins. To answer this, we use a mean-field approach to model the entire spindle, describing the forces and torques along microtubule bundles throughout the spindle. We compare our theoretical modelling to experimentally observed bundle shapes in the mitotic spindle, including both unperturbed and compressed spindles. We conclude that rotational forces are primarily responsible for the observed spindle shape. Furthermore, we discover that the difference in bending forces explains the difference in the shapes of the inner and outer bundles, that the chirality of the spindle is caused by a constant twisting moment and that there exists a preferred direction from microtubules arising out of the centrosome.Diobeno vreteno je stanična struktura koja je odgovorna za raspodjelu genetskog materijala medu stanicama kćeri, a sastoji se od mikrotubula i pridruženih proteina. Funkcionalno diobeno vreteno ima karakterističan oblik, sastojeći se od zakrivljenih svežnjeva mikrotubula, zakrenutih oko osi vretena. Potpuno razumijevanje linearnih i rotacionih sila, koje određuju cjelokupni oblik diobenog vretena te koje interakcije između mikrotubula i motornih proteina ih stvaraju, ostaje otvoreno pitanje. Predstavljamo metodu kojom je moguće izvući relevantne geometrijske parametre iz mikroskopskih slika diobenog vretena. Nadalje, uvodimo teorijski model diobenog vretena u kojem motorni proteini stvaraju sile i momente sila na polovima i duž svežnjeva mikrotubula, time regulirajući oblike svežnjeva mikrotubula. Iz modela dobivamo predviđanje oblika diobenog vretena, odnosno raspodjelu sila u diobenom vretenu, iz kojih možemo zaključiti da razlika u silama savijanja objašnjava razliku u obliku unutarnjih i vanjskih mikrotubula te da je cjelokupni oblik vretena većinski rezultat rotacionih sila. U prvom poglavlju opisana je struktura diobenog vretena, kao i njegova svojstva i uloga. Predstavljen je detaljni pregled biološke grade diobenog vretena i njegove strukture te je uloga diobenog vretena u staničnoj diobi i u stanici razjašnjena. Struktura diobenog vretena je razrađena sa posebnim naglaskom na svežnjeve mikrotubula i motornih proteina, koji svojim djelovanjem stvaraju sile i momente sila u diobenom vretenu. Uvedena je fizikalna teorija elastičnosti, s istaknutim dijelovima koji se koriste u radu za opis svežnjeva mikrotubula te je objašnjena opravdanost korištenja iste za opis stvarnih svežnjeva mikrotubula. Drugo poglavlje posvećeno je kiralnosti diobenog vretena, odnosno opisano je nedavno otkriće da se svežnjevi mikrotubula u diobenom vretenu namotavaju oko glavne osi diobenog vretena, tj. da nisu isključivo ravninski oblici. Objašnjena je pojava zavrnutih mikrotubula u diobenom vretenu, značaj tog uvrnuća za razumijevanje ravnoteže sila i momenata sila u diobenom vretenu te dosadašnji (neuspjeli) pokušaji kvantificiranja ovog uvinuća. Navedeno ujedno služi i kao uvod za opis glavnog cilja radnje, koji uključuje konstrukciju sveobuhvatnog modela diobenog vretena, koristeći aprokismaciju srednjeg polja, te prethodnu potrebu razvijanja metode koja će moći adekvatno izmjeriti uvrnuće svežnjeva mikrotubula u diobenom vretenu, kako bi se eksperimentalni podaci mogli dobro interpretirati te služiti za postavljanje, a potom i verifikaciju modela. U trećem poglavlju razvija se metoda kosog kruga (eng. Oblique Circle Method) koja se koristi služi za mjerenje uvinutosti mikrotubula. Prikazane su pretpostavke metode, ista je sistematički razrađena te u konačnici primijenjena i validirana na stvarnim ljudskim stanicama. Metoda je potom korištena za dobivanje zaključaka o strukturi diobenog vretena u perturbiranim i ne-perturbiranim ljudskim tumorskim stanicama, kao i stanicama amebe. Iz primjene metode dobiveni su zaključci o okomitim i paralelnim silama i momentima sila u diobenom vretenu. U četvrtom poglavlju uvodi se fizikalni model diobenog vretena, koji za cilj ima opis svih svežnjeva mikrotubula u metafaznom diobenom vretenu. Predstavljen je opis sustava od prebrojivo mnogo svežnjeva mikrotubula te je potom aproksimacijom srednjeg polja taj broj pušten u beskonačnost, kako bi se dobio kontinuirani model koji opisuje cjelokupno diobeno vreteno. Iz kontinuiranog modela je izračunata ravnoteža sila i momenata sila u čitavom diobenom vretenu nakon čega su svežnjevi mikrotubula opisani Kirchhoffovom jednadžbom za tanke štapove. Predstavljeni su ulazni i izlazni parametri modela, istražen je parametarski prostor modela te je biološki relevantan dio parametarskog prostora identificiran. U petom poglavlju je teorijski model uspoređen s eksperimentalnim podacima bioloških diobenih vretena, koristeći za usporedbu informacije dobivene uporabom metode kosog kruga na mikroskopske slike diobenog vretena. Teorijski model je uspoređen s više staničnih linija te su za svaku staničnu liniju pronađeni parametri koji ju najbolje opisuju, odnosno, određene su optimalne distribucije sila i momenata sila u diobenom vretenu. Iz distribucije sila i momenata sile, pokazano je da unutarnji i vanjski mikrotubuli imaju znatno različite okomite sile, no slične paralelne sile. Nadalje, model pokazuje da mikrotubuli iz centrosoma izviru pod kutom, odnosno ne ravno poput zraka sunca, već su sve okrenute prema jednoj strani, što je dosad u polju nerazmatran detalj, ali za njega postoje eksperimentalni dokazi, stoga na taj način model sugerira daljnje eksperimente. U šestom poglavlju su reiterirani glavni zaključci doktorskog rada, u vidu rezultata koji su dobiveni korištenjem samo metode kosog kruga, ali i teorijskog modela, te njegove usporedbe s eksperimentalnim podacima

Balance of forces and torques in a mean-field approximation in mitotic spindles

Diobeno vreteno je stanična struktura koja je odgovorna za raspodjelu genetskog materijala medu stanicama kćeri, a sastoji se od mikrotubula i pridruženih proteina. Sile i momenti sila igraju ključnu ulogu u funkcioniranju vretena te su odgovorni za pomicanje kromosoma i održavanje njegove grade, a važnu ulogu igraju elastična svojstva mikrotubula. Međutim, sile i momente nije lako odrediti današnjim eksperimentalnim tehnikama. U ovom teorijskom istraživanju uvodimo model za ravnotežu sila i momenata sila u diobenom vretenu. Korištenjem aproksimacije srednjeg polja opisujemo sve mikrotubule u diobenom vretenu, kao i sile i momente sila koje djeluju na njih. Model daje predvidanja za oblik diobenog vretena. Dobivene rezultate planiramo usporediti s eksperimentalno određenim oblicima koje su dobili naši suradnici. Teorijska predviđanja dobivena ovim modelom, zajedno s eksperimentima, trebala bi odgovoriti na pitanje kolike sile djeluju u diobenom vretenu.The mitotic spindle is a cellular structure which is responsible for the partition of genetic material when a cell divides into two daughter cells. It is comprised of microtubules and accompanying proteins. Forces and torques play a key role in the functioning of the spindle, for they are chiefly responsible for the movement of chromosomes and maintaining the overall shape of the spindle. This is facilitated by the elastic properties of microtubules. The forces and torques are, however, hard to determine with contemporary experimental techniques. In this theoretical research we develop a model for the balance of forces and torques in a mitotic spindle. Using a mean-field approximation we describe all microtubules in a mitotic spindle and the forces acting upon them. The model gives a prediction for the shape of the spindle. The results are to be matched to experimental imaging done by our associates, with the aim of answering what magnitude of forces and torques act in mitotic spindles

Ravnoteža sila i momenata sila u diobenom vretenu

In this thesis, I present results of my work over the last three years, carried out as a member of Pavin Group at the Faculty of Science, University of Zagreb. The mitotic spindle is a complex micro-machine composed of microtubules and associated proteins that must be highly ordered in space and time to function properly. A functional spindle has a distinct shape composed of curved bundles of microtubules twisted around the pole-to-pole axis. There is still a lack of understanding of how linear and rotational forces define the overall shape of the mitotic spindle, as well as how twisted shapes emerge as a result of interactions between microtubules and motor proteins. To answer this, we use a mean-field approach to model the entire spindle, describing the forces and torques along microtubule bundles throughout the spindle. We compare our theoretical modelling to experimentally observed bundle shapes in the mitotic spindle, including both unperturbed and compressed spindles. We conclude that rotational forces are primarily responsible for the observed spindle shape. Furthermore, we discover that the difference in bending forces explains the difference in the shapes of the inner and outer bundles, that the chirality of the spindle is caused by a constant twisting moment and that there exists a preferred direction from microtubules arising out of the centrosome.Diobeno vreteno je stanična struktura koja je odgovorna za raspodjelu genetskog materijala medu stanicama kćeri, a sastoji se od mikrotubula i pridruženih proteina. Funkcionalno diobeno vreteno ima karakterističan oblik, sastojeći se od zakrivljenih svežnjeva mikrotubula, zakrenutih oko osi vretena. Potpuno razumijevanje linearnih i rotacionih sila, koje određuju cjelokupni oblik diobenog vretena te koje interakcije između mikrotubula i motornih proteina ih stvaraju, ostaje otvoreno pitanje. Predstavljamo metodu kojom je moguće izvući relevantne geometrijske parametre iz mikroskopskih slika diobenog vretena. Nadalje, uvodimo teorijski model diobenog vretena u kojem motorni proteini stvaraju sile i momente sila na polovima i duž svežnjeva mikrotubula, time regulirajući oblike svežnjeva mikrotubula. Iz modela dobivamo predviđanje oblika diobenog vretena, odnosno raspodjelu sila u diobenom vretenu, iz kojih možemo zaključiti da razlika u silama savijanja objašnjava razliku u obliku unutarnjih i vanjskih mikrotubula te da je cjelokupni oblik vretena većinski rezultat rotacionih sila. U prvom poglavlju opisana je struktura diobenog vretena, kao i njegova svojstva i uloga. Predstavljen je detaljni pregled biološke grade diobenog vretena i njegove strukture te je uloga diobenog vretena u staničnoj diobi i u stanici razjašnjena. Struktura diobenog vretena je razrađena sa posebnim naglaskom na svežnjeve mikrotubula i motornih proteina, koji svojim djelovanjem stvaraju sile i momente sila u diobenom vretenu. Uvedena je fizikalna teorija elastičnosti, s istaknutim dijelovima koji se koriste u radu za opis svežnjeva mikrotubula te je objašnjena opravdanost korištenja iste za opis stvarnih svežnjeva mikrotubula. Drugo poglavlje posvećeno je kiralnosti diobenog vretena, odnosno opisano je nedavno otkriće da se svežnjevi mikrotubula u diobenom vretenu namotavaju oko glavne osi diobenog vretena, tj. da nisu isključivo ravninski oblici. Objašnjena je pojava zavrnutih mikrotubula u diobenom vretenu, značaj tog uvrnuća za razumijevanje ravnoteže sila i momenata sila u diobenom vretenu te dosadašnji (neuspjeli) pokušaji kvantificiranja ovog uvinuća. Navedeno ujedno služi i kao uvod za opis glavnog cilja radnje, koji uključuje konstrukciju sveobuhvatnog modela diobenog vretena, koristeći aprokismaciju srednjeg polja, te prethodnu potrebu razvijanja metode koja će moći adekvatno izmjeriti uvrnuće svežnjeva mikrotubula u diobenom vretenu, kako bi se eksperimentalni podaci mogli dobro interpretirati te služiti za postavljanje, a potom i verifikaciju modela. U trećem poglavlju razvija se metoda kosog kruga (eng. Oblique Circle Method) koja se koristi služi za mjerenje uvinutosti mikrotubula. Prikazane su pretpostavke metode, ista je sistematički razrađena te u konačnici primijenjena i validirana na stvarnim ljudskim stanicama. Metoda je potom korištena za dobivanje zaključaka o strukturi diobenog vretena u perturbiranim i ne-perturbiranim ljudskim tumorskim stanicama, kao i stanicama amebe. Iz primjene metode dobiveni su zaključci o okomitim i paralelnim silama i momentima sila u diobenom vretenu. U četvrtom poglavlju uvodi se fizikalni model diobenog vretena, koji za cilj ima opis svih svežnjeva mikrotubula u metafaznom diobenom vretenu. Predstavljen je opis sustava od prebrojivo mnogo svežnjeva mikrotubula te je potom aproksimacijom srednjeg polja taj broj pušten u beskonačnost, kako bi se dobio kontinuirani model koji opisuje cjelokupno diobeno vreteno. Iz kontinuiranog modela je izračunata ravnoteža sila i momenata sila u čitavom diobenom vretenu nakon čega su svežnjevi mikrotubula opisani Kirchhoffovom jednadžbom za tanke štapove. Predstavljeni su ulazni i izlazni parametri modela, istražen je parametarski prostor modela te je biološki relevantan dio parametarskog prostora identificiran. U petom poglavlju je teorijski model uspoređen s eksperimentalnim podacima bioloških diobenih vretena, koristeći za usporedbu informacije dobivene uporabom metode kosog kruga na mikroskopske slike diobenog vretena. Teorijski model je uspoređen s više staničnih linija te su za svaku staničnu liniju pronađeni parametri koji ju najbolje opisuju, odnosno, određene su optimalne distribucije sila i momenata sila u diobenom vretenu. Iz distribucije sila i momenata sile, pokazano je da unutarnji i vanjski mikrotubuli imaju znatno različite okomite sile, no slične paralelne sile. Nadalje, model pokazuje da mikrotubuli iz centrosoma izviru pod kutom, odnosno ne ravno poput zraka sunca, već su sve okrenute prema jednoj strani, što je dosad u polju nerazmatran detalj, ali za njega postoje eksperimentalni dokazi, stoga na taj način model sugerira daljnje eksperimente. U šestom poglavlju su reiterirani glavni zaključci doktorskog rada, u vidu rezultata koji su dobiveni korištenjem samo metode kosog kruga, ali i teorijskog modela, te njegove usporedbe s eksperimentalnim podacima

Balance of forces and torques in a mean-field approximation in mitotic spindles

Diobeno vreteno je stanična struktura koja je odgovorna za raspodjelu genetskog materijala medu stanicama kćeri, a sastoji se od mikrotubula i pridruženih proteina. Sile i momenti sila igraju ključnu ulogu u funkcioniranju vretena te su odgovorni za pomicanje kromosoma i održavanje njegove grade, a važnu ulogu igraju elastična svojstva mikrotubula. Međutim, sile i momente nije lako odrediti današnjim eksperimentalnim tehnikama. U ovom teorijskom istraživanju uvodimo model za ravnotežu sila i momenata sila u diobenom vretenu. Korištenjem aproksimacije srednjeg polja opisujemo sve mikrotubule u diobenom vretenu, kao i sile i momente sila koje djeluju na njih. Model daje predvidanja za oblik diobenog vretena. Dobivene rezultate planiramo usporediti s eksperimentalno određenim oblicima koje su dobili naši suradnici. Teorijska predviđanja dobivena ovim modelom, zajedno s eksperimentima, trebala bi odgovoriti na pitanje kolike sile djeluju u diobenom vretenu.The mitotic spindle is a cellular structure which is responsible for the partition of genetic material when a cell divides into two daughter cells. It is comprised of microtubules and accompanying proteins. Forces and torques play a key role in the functioning of the spindle, for they are chiefly responsible for the movement of chromosomes and maintaining the overall shape of the spindle. This is facilitated by the elastic properties of microtubules. The forces and torques are, however, hard to determine with contemporary experimental techniques. In this theoretical research we develop a model for the balance of forces and torques in a mitotic spindle. Using a mean-field approximation we describe all microtubules in a mitotic spindle and the forces acting upon them. The model gives a prediction for the shape of the spindle. The results are to be matched to experimental imaging done by our associates, with the aim of answering what magnitude of forces and torques act in mitotic spindles

Balance of forces and torques in a mean-field approximation in mitotic spindles

Diobeno vreteno je stanična struktura koja je odgovorna za raspodjelu genetskog materijala medu stanicama kćeri, a sastoji se od mikrotubula i pridruženih proteina. Sile i momenti sila igraju ključnu ulogu u funkcioniranju vretena te su odgovorni za pomicanje kromosoma i održavanje njegove grade, a važnu ulogu igraju elastična svojstva mikrotubula. Međutim, sile i momente nije lako odrediti današnjim eksperimentalnim tehnikama. U ovom teorijskom istraživanju uvodimo model za ravnotežu sila i momenata sila u diobenom vretenu. Korištenjem aproksimacije srednjeg polja opisujemo sve mikrotubule u diobenom vretenu, kao i sile i momente sila koje djeluju na njih. Model daje predvidanja za oblik diobenog vretena. Dobivene rezultate planiramo usporediti s eksperimentalno određenim oblicima koje su dobili naši suradnici. Teorijska predviđanja dobivena ovim modelom, zajedno s eksperimentima, trebala bi odgovoriti na pitanje kolike sile djeluju u diobenom vretenu.The mitotic spindle is a cellular structure which is responsible for the partition of genetic material when a cell divides into two daughter cells. It is comprised of microtubules and accompanying proteins. Forces and torques play a key role in the functioning of the spindle, for they are chiefly responsible for the movement of chromosomes and maintaining the overall shape of the spindle. This is facilitated by the elastic properties of microtubules. The forces and torques are, however, hard to determine with contemporary experimental techniques. In this theoretical research we develop a model for the balance of forces and torques in a mitotic spindle. Using a mean-field approximation we describe all microtubules in a mitotic spindle and the forces acting upon them. The model gives a prediction for the shape of the spindle. The results are to be matched to experimental imaging done by our associates, with the aim of answering what magnitude of forces and torques act in mitotic spindles

Industrial Informatics: Emerging Trends and Applications in the Era of Big Data and AI

Industrial informatics is a rapidly developing scientific field that deals with the knowledge-based automation of industrial design and manufacturing processes. In the last decade, industrial informatics has been strongly influenced by the rapid rise of data-based technologies such as Data Science, Big Data, and artificial intelligence. The goal of this paper is to provide a literature review of academic research analyzing the extensive spectrum of industrial informatics. Articles indexed in Scopus with the term “Industrial Informatics” in the title, abstract, or keywords were extracted since the term emerged in the 1990s, over a period of 29 years. The main journals, conferences, authors and countries were studied using bibliometric analysis. Text mining using VosViewer was used to extract the thematic groups of research related to industrial informatics, which are as follows: (i) Internet of Things, (ii) machine learning, (iii) engineering education, (iv) cyber–physical systems, and (v) embedded systems. We also found that China, Germany, and Brazil dominate research in industrial computing. The results showed that research in industrial informatics is related to the emergence of new methods and tools, and is nowadays shifting towards the application of intelligent methods such as machine learning and Big Data