Caractérisation des domaines génomiques réparés dans les cellules humaines XP-C

Les dimères de pyrimidines causés par les rayonnements ultra-violets sont réparés par un mécanisme d’excision. Les cellules en culture provenant de patients souffrant de Xeroderma Pigmentosum ont une déficience dans la réparation de ces lésions, en particulier, les cellules XP du groupe C ne réparent que 15-20 % des dimères produits. Pour vérifier si cette réparation se limite à certains domaines spécifiques du génome, nous avons mesuré la distribution des zones de réparation selon la complexité des séquences par la méthode de Cot, et vérifié si la transcription est nécessaire pour la réparation. Les zones réparées chez XP-C, sont distribuées dans tout le génome mais de façon plus importante dans les séquences répétitives (réparation relative: séquences hautement répétitives, 1,133 ; séquences moyennement répétitives, 1,035; séquences copie unique, 0,938). Tandis que chez les cellules normales, la réparation est légèrement plus élevée dans les séquences uniques (réparation relative: 0,818 ; 0,879; 1,120). Pour vérifier l’influence de la transcription, nous avons mesuré la synthèse de réparation par l’incorporation de nucléotides radioactifs et l’accumulation des sites incisés par élution alcaline en présence d’un inhibiteur de la transcription, l’α-amanitine. Nous avons ainsi observé une inhibition de 80-100% de la réparation chez les cellules XP-C, 3 heures après irradiation aux ultraviolets (20 J/m2). Par contre, chez les cellules normales l’effet est presque nul. Ces résultats suggèrent un rôle de la transcription dans la réparation par excision

Purification de fragments d’ADN humain contenant une zone de réparation par excision

Dans le but d’étudier la réparation de l’ADN dans des séquences spécifiques du génome humain, nous avons développé une méthode pour purifier des fragments d’ADN contenant une zone de réparation par excision. Le principe consiste à incorporer dans les zones réparées, le désoxyuridine monophosphate marqué à la biotine, une molécule pour laquelle la streptavidine a une haute affinité. Le complexe biotine-streptavidine confère aux fragments d’ADN marqués de nouvelles propriétés permettant leur purification. Plus précisément, nous avons utilisé des fibroblastes humains normaux endommagés avec les rayons UV, que nous avons perméabilisés puis incubés en présence d’ATP, dATP, dGTP, [3H]dCTP et biodUTP pour permettre la synthèse réparatrice. L’ADN a ensuite été purifié, fragmenté par sonication en fragments d’environ 150 pb puis incubé avec la streptavidine (Kd du complexe biotine libre-streptavidine 10-15) ayant une densité de 1,33 g/ml dans le CsTFA comparé à 1,6 g/ml pour l’ADN non-marqué. La centrifugation isopycnique résulte en la séparation des fragments d’ADN réparés et marqués à la biotine de ceux non-réparés. Cette méthode est applicable pour tous types de dommages à l’ADN réparés par la voie d’excision-resynthèse incluant les dommages causés par les carcinogènes chimiques et les radiations ionisantes