Novel dimeric DOTA-coupled peptidic Y1-receptor antagonists for targeting of neuropeptide Y receptor-expressing cancers

ABSTRACT

Étude des relations structure-activité sur la position 6 de l’urotensine related peptide.

Malgré les traitements actuels, l’hypertension artérielle pulmonaire continue de demeurer un problème de santé majeur. Le système urotensinergique, composé du récepteur à 7 domaines transmembranaire UT et des ligands peptidiques urotensine II (UII) et urotensin II-related peptide (URP), est considéré comme un acteur important du développement et de la progression de cette pathologie. En accord avec leurs activités biologiques semblables mais également distinctes, nous avons suggéré que ces deux peptides pouvaient stabiliser des conformations particulières d'UT, menant ainsi à un profil signalétique différent pour chacun des peptides, phénomène connu sous le nom de sélectivité fonctionnelle. Nous avons alors émis l'hypothèse que certains acides aminés présents dans l'UII et/ou l'URP pourraient avoir une implication différente dans la fixation et l'activation d'UT. En accord avec cette hypothèse, il fut observé que le [Pep4]URP se comporte comme antagoniste de la contraction d'anneaux d’aorte de rat induite par l’UII, contrairement à son homologue [Pep7]UII qui lui agit comme un agoniste. L'objectif de cette étude est de mieux caractériser les déterminants physico-chimiques du résidu en position 6 de l'URP menant à ces activités différentielles entre l'UII et l'URP. Plusieurs analogues ont ainsi été synthétisés en phase solide et leur profil pharmacologique fut évalué à l’aide d’un test de contraction d’anneaux aortique de rat. Nos résultats démontrent que (1) l'inversion de configuration provoque une baisse importante de la contraction et (2) l’encombrement stérique en para du cycle aromatique semble être un facteur modulant la puissance de contraction.</p

Conception et caractérisation de modulateurs du système urotensinergique.

L’urotensine II (UII), peptide cyclique initialement isolé à partir de l’urophyse des poissons téléostéens, est considérée comme le plus puissant vasoconstricteur identifié à ce jour. Bien que l’UII soit connue chez les poissons depuis 1980, il a fallu attendre la fin des années 90 pour découvrir son récepteur; un RCPG orphelin humain, dont l’orthologue de rat est connu sous le nom de GPR14. Dans les conditions physiopathologiques, les effets inotropes et hypertrophiques de l’UII semblent contribuer au développement de l’insuffisance cardiaque. De plus, la présence de l’UII et/ou l’URP (Urotensin Related Peptide) dans les motoneurones suggère que ces peptides pourraient être impliqués dans la modulation de l’activité neuromusculaire, en conditions normales et/ou pathologiques. Le système urotensinergique présente donc un potentiel clinique énorme dans la prévention et le traitement de différentes pathologies. Des études précliniques ont ainsi montré les effets bénéfiques des antagonistes de l’UII dans diverses maladies. Cependant, des études indiquent qu’il pourrait exister un autre récepteur de l’UII. En effet, l’UII a un pouvoir vasodilatateur dix fois plus important que son pouvoir vasoconstricteur, ce qui pourrait résulter d’une différence d’affinité du peptide pour deux récepteurs distincts, d’où l’intérêt de développer également des agonistes du système urotensinergique. Dans cette étude, nous décrivons la conception rationnelle de nouveaux agonistes peptidiques contraints de l’URP. Les différents analogues synthétisés ont ensuite été évalués dans divers systèmes pour évaluer leur profil pharmacologique; la première phase consistant à mesurer l’affinité de chaque analogue pour son récepteur puis à tester les composés capables de se lier dans un modèle ex vivo de contraction d’anneaux d’aorte de rat. Au cours de cette étude nous avons ainsi pu identifier plusieurs modifications permettant de générer de puissants analogues de l’URP. La conception de ligands agonistes et antagonistes du GPR14 devrait permettre à long terme de développer des applications thérapeutiques pour le traitement de certaines pathologies, cardiovasculaires et/ou neuromusculaires

Implication de l'oligomérisation du récepteur ut dans la sélectivité foctionelle de l'urotensine II et de l'urotensine II-related peptide

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont impliqués dans le contrôle d'un large éventail de fonctions physiologiques. Alors que l’on croyait que ces derniers existaient et fonctionnaient en tant que qu'espèces monomèriques, des preuves irréfutables et multiples ont clairement démontré l'existence de complexe oligomèrique. Le système urotensinergique composé de l’urotensine II (UII), de l’urotensine II-related peptide II (URP) et d'un RCPG appelé UTest impliqué dans le développement des maladies cardiovasculaires.Bien que les deux ligands partagent le même récepteur, ces derniers sont capablesd'exercer des actions physiologiques divergentes; chaque peptide déclenchant probablement son propre ensemble de second messagers. Étant donné que l’oligomérisation des RCPG semble être impliqué dans leur diversité pharmacologique, nous avons émis l'hypothèse que les divergences observées entre les deux ligands sontdues à une oligomérisationde UT. Pour confirmer notre hypothèse, nous aurons recours à troistechniques complémentaires à savoir le photomarquage, le TR-FRET, la technique du FlAsH-walk et des essais de liaison.Les techniques de photomarquage et de TR-FRET nous permettrons de démontrer la présence de formes dimériques de UT alors que les essais de liaison nous permettrons de mesurerla coopérativité entre les deux protomères formant le dimère.La technique du FlAsH-walknous permettra de faire une cartographie des mouvements dynamiques au niveau de UT impliqué dans la formation du complexe. Les informations récupérées à travers ce projet vont sans aucun doute mener à une meilleure compréhension de la pharmacologie complexe de ce système et à la caractérisation de nouveaux oligomères pharmacologiques / thérapeutiques potentiellement pertinents.</p

L'acide aminée PHE-6 joue un rôle significatif dans l'activité biologique du pacap, un peptide neuroprotecteur

Le pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) possède des propriétés neuroprotectrices dans des modèles de dégénérescence neuronale. Il est présent sous deux isoformes de 27 et 38 acides aminés, passe la barrière hémato-encéphalique et ses actions sont médiées via trois récepteurs (PAC1, VPAC1 et VPAC2). Notre objectif est de concevoir des dérivés du PACAP capables d’activer sélectivement le récepteur PAC1, responsable de l’activité neuroprotectrice. Des études ont suggéré que la phénylalanine-6 (Phe-6) est un pharmacophoreclé du PACAP. Nous avons donc évalué la relation entre l’affinité et l’activité biologique de ce peptide et les propriétés physicochimiques du résidu de la position 6 en le remplaçant par différents dérivés tryptophanyles obtenus par arylation du noyau indole. D’une part, des tests d’affinité ont été effectués sur des cellules CHO exprimant l’un ou l’autre des récepteurs. D’autre part, l’activité biologique a été déterminée par des mesures de mobilisation calcique sur des cellules CHO exprimant PAC1. Les résultats suggèrent que l’aromaticité et/ou l’hydrophobicité en position 6 sont déterminantes pour la liaison et l’activation de PAC1. Toutefois, il semble que la chaîne latérale du résidu doive respecter certaines limites au niveau de sa dimension, car les substitutions de l’indole ont eu un impact défavorable sur l’affinité. Nos travaux antérieurs avaient montré que l’hydrophobicité était essentielle pour la position 6, probablement pour le maintien d’une structure secondaire appelée « N-capping ». L’étude actuelle supporte cette observation et confirme l’apport significatif de la position 6 pour l’activité biologique PAC1-dépendante.</p

Étude de l'effet neuroprotecteur du PACAP sur l'excitotoxicité et l'inflammation, deux phénomènes observés au cours de la maladie de Parkinson

Le Pituitary Adenylate Cyclase-Activating Polypeptide (PACAP) est un neuropeptide initialement isolé à partir d’extraits hypothalamiques ovins pour sa capacité à stimuler la production d’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) dans des cellules hypophysaires antérieures. Capable d’interagir avec trois récepteurs distincts, i.e. PAC1, VPAC1 et VPAC2, le PACAP exerce une action pléiotrope sur les systèmes cardiovasculaire, nerveux, respiratoire, digestif, endocrinien, reproducteur et immunitaire. En particulier, de puissants effets neuroprotecteurs ont été observés avec le PACAP dans divers modèles d’atteintes neurologiques in vitro et in vivo, incluant la maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer. Ainsi, il a été démontré que ce peptide favorise la survie neuronale en inhibant directement l’apoptose via l’activation du récepteur PAC1. Enfin, le PACAP protège les neurones de l’excitotoxicité induite par le glutamate, observée au cours de certaines maladies neurodégénératives. De par ses propriétés neurotrophiques et neuroprotectrices permettant le contrôle de la prolifération, de la différenciation et de la survie cellulaire, le PACAP représente donc un candidat prometteur pour le traitement de diverses atteintes cérébrales caractérisées par une inflammation et une excitotoxicité excessives. L’étude réalisée durant ce travail a démontré dans un premier temps que le PACAP protégeait in vitro et in vivo contre l’effet neurotoxique du MPP+ (composé mimant in vitro la maladie de Parkinson) et du MPTP et qu’il possédait in vitro un effet anti-excitotoxique contre le glutamate. Dans un second temps, nous avons montré que le PACAP possède un effet anti-inflammatoire vis-à-vis de l’inflammation induite par le MPTP in vivo et ce, en évaluant par RT-qPCR quelques cytokines inflammatoires

Mise en lumière du méchanisme d'activation du récepteur UT

Le système urotensinergique, composé de l'urotensine II (UII), de l’urotensin II-related peptide (URP) et d'un RCPG (UT) est considéré comme une cible prometteuse pour le traitement de l’athérosclérose. Cependant, en raison de la complexité du mécanisme d'action impliqué dans l'activation du récepteur, et bien que plusieurs études chez les animaux aient démontré le potentiel d'UT comme cible thérapeutique, les essais cliniques chez l'homme ont eu un succès limité. Il apparaît donc décisif de mieux comprendre les interactions liées à l'activation de UT. En raison de son rôle divergent dans l'activité biologique de UII et URP, nous avons émis l'hypothèse que le résidu Tyr pourrait jouer un rôle crucial dans les processus de liaison et d'activation de UT par UII et URP. Plusieurs peptides, dérivés de l'URP et modifiés au niveau du résidu Tyr, ont été synthétisés et leur affinité pour le récepteur UT ainsi que leur capacité à recruter Gq fut évalué in vitro sur des cellules HEK293-UT. Leur habileté à induire la contraction d'anneaux d'aortes de rats a également été mesurée. Alors que [Phe(pI)6]URP, aux propriétés physico-chimiques similaires à l’URP, retient des caractéristiques biologiques identiques, [Pep6]URP possède une affinité équivalente pour UT mais une puissance de contraction 20 fois moins importante que URP, soit une dichotomie entre l’affinité et l’activité qui est également retrouvée au niveau du recrutement de Gq. Ces résultats suggèrent ainsi une interaction en deux étapes avec le récepteur impliquant un ajustement induit réciproque. La considération de cette exigence conformationnelle guidera les conceptions thérapeutiques futures.</p

Le pituitary adenylate-cyclase activating polypetide: thérapie potentielle pour les maladies neurodégénératives.

Le PACAP (pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide) a été initialement isolé sur la base de sa capacité à stimuler la production d’AMPc dans des cellules anté-hypophysaires en culture. Participant à la régulation de nombreux phénomènes physiologiques, le PACAP exerce ses effets via l’activation de trois récepteurs couplés aux protéines G : PAC1, VPAC1 et VPAC2. En agissant comme inhibiteur de la voie de la caspase-3, suite à l’activation du récepteur PAC1, le PACAP s’est avéré être un puissant agent antiapoptotique. In vitro, le PACAP réduit considérablement la neurodégénérescence induite par l’exposition à certains agents neurotoxiques (H2O2, glutamate, éthanol, céramides, MPP+) et procure in vivo un effet neuroprotecteur dans certains modèles d’atteintes du cerveau (ischémie, Parkinson, Huntington, Alzheimer, trauma). Le PACAP est ainsi capable de réduire de 50% la zone d’infarcie même après avoir été administré 4h après le début de l’ischémie. De par sa caractère hydrophile et la présence d’un transporteur spécifique, le PACAP est capable de traverser la barrière hémato-encéphalique en faisant ainsi un très bon candidat pour le traitement de diverses maladies ou atteintes du système nerveux central. Dans cette étude, nous examinerons le potentiel thérapeutique du PACAP et à démontrer l’intérêt de développer des analogues sélectif et stables de ce neuropeptide. Des modifications spécifiques ont été effectuées au niveau du domaine N-terminal du peptide. Ces analogues sont ensuite évalués afin d’établir leur capacité à lier et à activer chacun des trois sous-types de récepteurs PAC1, VPAC1 et VPAC2. Nos résultats confirment le caractère essentiel des résidus His1, Asp3, Leu5 et Phe6 dans la liaison et l’activation du PACAP aux différents récepteurs. De plus, des modifications à la position 7 du peptide pourraient moduler la sélectivité des analogues pour les récepteurs PAC1 et VPAC1. Ce résultat est une piste importante pour le développement d’analogues sélectifs PAC1, qui pourraient avoir des applications thérapeutiques dans le traitement de pathologies neurodégénératives

Poisons naturels ou médecine de demain: identification de deux toxines à fort potentiel thérapeutique dans le venin du serpent Naja Kaouthia.

Au cours de l’évolution, les espèces venimeuses ont développé des stratégies extrêmement sophistiquées pour se nourrir et/ou se protéger. Cette pression évolutive a abouti à la production de nombreuses toxines capables d’altérer d’importantes fonctions physiologiques via une action spécifique et simultanée sur diverses cibles biologiques. Le venin de ces prédateurs a d’ores et déjà permis l’identification de nombreuses substances (antidiabétique, anticoagulant, analgésique) dont la sélectivité dépasse souvent celle de certains agents pharmacologiques actuels. Au sein de notre laboratoire, nous nous intéressons plus particulièrement à l’identification de nouveaux agents insulinotropes et neurodifférenciateurs isolés à partir de Naja kaouthia, un cobra retrouvé entre autres au Vietnam. Dans un premier temps, les peptides et protéines du venin de cobra ont été semi-purifiés par tamis moléculaire. Ensuite, nous nous sommes concentrés sur la fraction contenant des polypeptides de masses comprises entre 3kDa et 10kDa. Ces derniers ont été ensuite purifiés par HPLC sur phase inverse et analysés par spectrométrie de masse. L’activité insulinotrope de chaque fraction post HPLC a été mesurée au moyen d’une lignée dérivée de cellules pancréatiques nommée INS-1E. Également, puisque la présence de molécules de type NGF-like a été observée dans de nombreux venins, nous avons vérifié avec la lignée cellulaire PC12, laquelle représente un modèle de différenciation de cellules nerveuses, l’effet de nos différentes fractions sur la croissance des neurites. Les premiers résultats ont montré qu’une fraction est capable de stimuler la sécrétion d’insuline, et ce même en absence de glucose. Elle pourrait donc avoir un intérêt indéniable dans le développement d’un nouveau traitement du diabète de type II insulinodépendant. De même, 3 fractions, distinctes de la précédente, se sont avérées aptes à stimuler la croissance des neurites dans des cellules PC12, rendant ces molécules potentiellement avantageuses dans le traitement de maladies neurodégénératives