Minute time scale prolyl isomerization governs antibody recognition of an intrinsically disordered immunodominant epitope

Conformational rearrangements in antibody·antigen recognition are essential events where kinetic discrimination of isomers expands the universe of combinations. We investigated the interaction mechanism of a monoclonal antibody, M1, raised against E7 from human papillomavirus, a prototypic viral oncoprotein and a model intrinsically disordered protein. The mapped 12-amino acid immunodominant epitope lies within a "hinge" region between the N-terminal intrinsically disordered and the C-terminal globular domains. Kinetic experiments show that despite being within an intrinsically disordered region, the hinge E7 epitope has at least two populations separated by a high energy barrier. Nuclear magnetic resonance traced the origin of this barrier to a very slow (t(1/2)∼4 min) trans-cis prolyl isomerization event involving changes in secondary structure. The less populated (10%) cis isomer is the binding-competent species, thus requiring the 90% of molecules in the trans configuration to isomerize before binding. The association rate for the cis isomer approaches 6 × 10(7) M(-1) s(-1), a ceiling for antigen-antibody interactions. Mutagenesis experiments showed that Pro-41 in E7Ep was required for both binding and isomerization. After a slow postbinding unimolecular rearrangement, a consolidated complex with K(D) = 1.2 × 10(-7) M is reached. Our results suggest that presentation of this viral epitope by the antigen-presenting cells would have to be "locked" in the cis conformation, in opposition to the most populated trans isomer, in order to select the specific antibody clone that goes through affinity and kinetic maturation.Fil: Fassolari, Marisol. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Chemes, Lucia Beatriz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Gallo, Mariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Smal, Clara. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; ArgentinaFil: Sanchez, Ignacio E.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: de Prat Gay, Gonzalo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; Argentin

Culex quinquefasciatus larvae development arrested when fed on Neochloris aquatica

Culex quinquefasciatus is a cosmopolitan species widely distributed in the tropical and subtropical areas of the world. Due to its long history of close association with humans, the transmission of arboviruses and parasites have an important role in veterinary and public health. Adult females feed mainly on birds although they can also feed on humans and other mammals. On the other hand, larvae are able to feed on a great diversity of microorganisms, including microalgae, present in natural or artificial breeding sites with a high organic load. These two particularities, mentioned above, are some of the reasons why this mosquito is so successful in the environment. In this work, we report the identification of a microalga found during field sampling in artificial breeding sites, in a group of discarded tires with accumulated rainwater. Surprisingly, only one of them had a bright green culture without mosquito larvae while the other surrounding tires contained a large number of mosquito larvae. We isolated and identified this microorganism as Neochloris aquatica, and it was evaluated as a potential biological control agent against Cx. quinquefasciatus. The oviposition site preference in the presence of the alga by gravid females, and the effects on larval development were analyzed. Additionally, microalga effect on Cx. quinquefasciatus wild type, naturally infected with the endosymbiotic bacterium Wolbachia (w+) and Wolbachia free (w−) laboratory lines was explored. According to our results, even though it is chosen by gravid females to lay their eggs, the microalga had a negative effect on the development of larvae from both populations. Additionally, when the larvae were fed with a culture of alga supplemented with balanced fish food used as control diet, they were not able to reverse its effect, and were unable to complete development until adulthood. Here, N. aquatica is described as a biological agent, and as a potential source of bioactive compounds for the control of mosquito populations important in veterinary and human health.Fil: Gil, María Florencia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; ArgentinaFil: Fassolari, Marisol. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; ArgentinaFil: Battaglia, Marina Esther. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; ArgentinaFil: Berón, Corina Marta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Biotecnología; Argentin

Different types domains are present in complex I from immature seeds and of CA adult plants in Arabidopsis thaliana

Mitochondrial Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) dehydrogenase complex is the first complex of the mitochondrial electron transfer chain. In plants and in a variety of eukaryotes except Opisthokonta, complex I (CI) contains an extra spherical domain called carbonic anhydrase (CA) domain. This domain is thought to be composed of trimers of gamma type CA and CA-like subunits. In Arabidopsis, the CA gene family contains five members (CA1, CA2, CA3, CAL1 and CAL2). The CA domain appears to be crucial for CI assembly and is essential for normal embryogenesis. As CA and CA-like proteins are arranged in trimers to form the CA domain, it is possible for the complex to adopt different arrangements that might be tissue-specific or have specialized functions. In this work, we show that the proportion of specific CI changes in a tissue-specific manner. In immature seeds, CI assembly may be indistinctly dependent on CA1, CA2 or CA3. However, in adult plant tissues (or tissues derived from stem cells, as cell cultures), CA2-dependent CI is clearly the most abundant. This difference might account for specific physiological functions. We present evidence suggesting that CA3 does not interact with any other CA family member. As CA3 was found to interact with CI FRO1 (NDUFS4) subunit, which is located in the matrix arm, this suggests a role for CA3 in assembly and stability of CI.Fil: Córdoba, Juan Pablo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Fassolari, Marisol. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Marchetti, Maria Fernanda. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Soto, Débora. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Pagnussat, Gabriela Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Zabaleta, Eduardo Julian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Investigaciones Biológicas; Argentin

Recognition mechanism of an intrinsically disordered epitope by a monoclonal antibody: mechanistic and structural integration

El reconocimiento de antígenos por medio de anticuerpos es un evento fundamental en la respuesta inmune adaptativa. A su vez la formación de los complejos Antígeno:Anticuerpo es extensivamente utilizada como modelo de estudio de interacción proteína-proteína. En la presente tesis estudiamos el mecanismo de reconocimiento de un anticuerpo monoclonal específico, M1, por la proteína E7 del papilomavirus humano (HPV). E7 es la oncoproteína que constituye la principal actividad transformante del virus y además es paradigma de proteínas intrínsecamente desordenadas (IDP). E7 se expresa constitutivamente en tejidos de carcinoma y la aparición de anticuerpos específicos ocurre con alta frecuencia en pacientes con cáncer cervical. Llevando a cabo un mapeo epitópico determinamos que el anticuerpo M1 reconoce específicamente una región inmunodominante de la proteína de HPV- 16 denominada “bisagra”, por conectar el dominio IDP N-terminal con el dominio globular Cterminal de la misma. Experimentos cinéticos mostraron que la región reconocida por M1, la cual posee dos residuos de prolina, comprende al menos dos poblaciones separadas por una alta barrera energética (~ 22 Kcal/mol). Los estudios de Resonancia Magnética Nuclear identificaron el origen de esta barrera como un evento de isomerización cis-trans de las prolinas presentes en el epítope de reconocimiento. Se determinó que el anticuerpo M1 reconoce específicamente al epítope en su conformación minoritaria (10%), que posee sus prolinas en cis, mediante el mecanismo de selección conformacional. Por lo tanto, se requiere que el 90% de las moléculas que se encuentran en configuración trans isomericen previo a la unión con el anticuerpo. La velocidad de asociación del conformero cis por M1 ( kon = 6 x 107 M-1 s-1) se encuentra entre las más rápidas para las interacciones Antígeno:Anticuerpo, a pesar de que la reacción global es extremadamente lenta (t1/2 ~ 4 min). Esto indica que la reacción de asociación se encuentra limitada por un evento de isomerización de prolina. Utilizando mutantes puntuales demostramos que la P41 en su conformación cis es la requerida para la unión con el anticuerpo. Luego del evento lento de pre-equilibrio y de la unión con M1, ocurre un evento de rearreglo unimolecular, formándose finalmente un complejo consolidado de alta afinidad (KD 120 nM). Nuestros resultados sugieren que la presentación de este epítope viral por las células presentadoras de antígeno tiene que haber estado en su configuración minoritaria cis, al generar el clon que produce el anticuerpo específico. Finalmente, mostramos la importancia de los determinantes estructurales presentes en regiones desordenadas en el reconocimiento entre macromoléculas. Dado que numerosas proteínas virales son multifuncionales debido a su naturaleza IDP, los resultados presentados en esta tesis sientan la bases para el análisis del mecanismo de reconocimiento por medio de anticuerpos de epítopes virales intrínsecamente desordenados.Recognition of antigens by antibodies is a critical event in the adaptive immune response. Furthermore, the Antigen:Antibody complex is extensively used as a model of protein-protein interactions. In the present thesis, we present a detailed mechanistic study of the interaction between a specific monoclonal antibody, M1, with the E7 oncoprotein of human papillomavirus. E7 is the main transforming factor of this virus and also emerges as a paradigmatic example of an intrinsically disordered protein or IDP. E7 is constitutively expressed at high levels in carcinoma tissues and antibodies are frequently raised in patients with cervical cancer. Epitope mapping studies reveal that the M1 antibody specifically recognizes an immunodominant region of the HPV-16 E7 protein called "hinge", located between the IDP N-terminal and the globular C-terminal domains of the protein. Kinetic experiments show that this hinge, which has two proline residues, has at least two populations separated by a high energy barrier (~ 22 kcal / mol). Nuclear magnetic resonance traced the origin of this barrier to a very slow trans/cis prolyl isomerization event present in E7 epitope. The less populated (10%) cis isomer is the binding-competent species. Thus, the 90% of the molecules in the trans configuration require isomerization before binding. The association rate for the cis isomer approaches 6x107 M-1s-1, a ceiling for antigen-antibody interactions, although the overall reaction is extremely slow (t1/2 ~ 4 min). Therefore, the E7 epitope:M1 antibody complex formation is limited by a proline isomerization event. Mutagenesis experiments showed that Pro 41 in the epitope was required for both binding and isomerization. After the slow pre-equilibrium event and M1 binding, a post-binding unimolecular event occurs and a consolidated complex with a KD = 1.2!10-7 M is reached. Our results suggest that presentation of this viral epitope by the antigen presenting cells would have to be “locked” in the cis conformation in opposition to the most populated trans isomer in order to select the specific antibody clone. Finally, we show the importance of the structural determinants within disordered regions in the recognition mechanism between macromolecules. Many viral proteins are multifunctional due to its IDP nature. Therefore, the results presented in this thesis establish the basis for the analysis of the recognition mechanism by antibodies of intrinsically disordered viral epitopes.Fil:Fassolari, Marisol. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Functional study of the family of Aurora kinases enzymes in Trypanosoma cruzi

Las proteínas de la familia Aurora quinasa son un grupo de enzimas con gran relevancia en el proceso de división celular. Estas enzimas fueron descriptas en una gran variedad de organismos y han mostrado estar altamente conservadas en la evolución. El número de miembros de esta familia varía entre organismos y van desde uno en levaduras hasta tres en mamíferos. Entre los procesos donde están involucradas se destacan la maduración y división del centrosoma, condensación de la cromatina, ensamblado del huso mitótico, corrección de errores en la unión de los microtúbulos al cinetocoro e iniciación de la citocinesis. En este trabajo estudiamos tres Aurora quinasa (TcAUK1, -2 y -3) en Trypanosoma cruzi, determinando su organización génica y perfil de expresión a lo largo del ciclo de vida del parásito. También, se han iniciado los estudios funcionales de estas enzimas mediante experimentos de localización subcelular y sobreexpresión. De esta manera, se pudo determinar que las Aurora quinasa de T. cruzi están reguladas no tan solo a través de los niveles de proteína, sino también a través de su localización subcelular, y que la sobreexpresión de cada una de ellas conduce a alteraciones del ciclo celular y la curva de crecimiento. Palabras clave: Trypanosoma cruzi, Enfermedad de Chagas, Aurora quinasa, ciclo celular, citoquinesis

Mecanismo de reconocimiento de un epítope intrínsecamente desordenado por un anticuerpo monoclonal: integración mecanística y estructural

El reconocimiento de antígenos por medio de anticuerpos es un evento fundamental en la respuesta inmune adaptativa. A su vez la formación de los complejos Antígeno:Anticuerpo es extensivamente utilizada como modelo de estudio de interacción proteína-proteína. En la presente tesis estudiamos el mecanismo de reconocimiento de un anticuerpo monoclonal específico, M1, por la proteína E7 del papilomavirus humano (HPV). E7 es la oncoproteína que constituye la principal actividad transformante del virus y además es paradigma de proteínas intrínsecamente desordenadas (IDP). E7 se expresa constitutivamente en tejidos de carcinoma y la aparición de anticuerpos específicos ocurre con alta frecuencia en pacientes con cáncer cervical. Llevando a cabo un mapeo epitópico determinamos que el anticuerpo M1 reconoce específicamente una región inmunodominante de la proteína de HPV- 16 denominada “bisagra”, por conectar el dominio IDP N-terminal con el dominio globular Cterminal de la misma. Experimentos cinéticos mostraron que la región reconocida por M1, la cual posee dos residuos de prolina, comprende al menos dos poblaciones separadas por una alta barrera energética (~ 22 Kcal/mol). Los estudios de Resonancia Magnética Nuclear identificaron el origen de esta barrera como un evento de isomerización cis-trans de las prolinas presentes en el epítope de reconocimiento. Se determinó que el anticuerpo M1 reconoce específicamente al epítope en su conformación minoritaria (10%), que posee sus prolinas en cis, mediante el mecanismo de selección conformacional. Por lo tanto, se requiere que el 90% de las moléculas que se encuentran en configuración trans isomericen previo a la unión con el anticuerpo. La velocidad de asociación del conformero cis por M1 ( kon = 6 x 107 M-1 s-1) se encuentra entre las más rápidas para las interacciones Antígeno:Anticuerpo, a pesar de que la reacción global es extremadamente lenta (t1/2 ~ 4 min). Esto indica que la reacción de asociación se encuentra limitada por un evento de isomerización de prolina. Utilizando mutantes puntuales demostramos que la P41 en su conformación cis es la requerida para la unión con el anticuerpo. Luego del evento lento de pre-equilibrio y de la unión con M1, ocurre un evento de rearreglo unimolecular, formándose finalmente un complejo consolidado de alta afinidad (KD 120 nM). Nuestros resultados sugieren que la presentación de este epítope viral por las células presentadoras de antígeno tiene que haber estado en su configuración minoritaria cis, al generar el clon que produce el anticuerpo específico. Finalmente, mostramos la importancia de los determinantes estructurales presentes en regiones desordenadas en el reconocimiento entre macromoléculas. Dado que numerosas proteínas virales son multifuncionales debido a su naturaleza IDP, los resultados presentados en esta tesis sientan la bases para el análisis del mecanismo de reconocimiento por medio de anticuerpos de epítopes virales intrínsecamente desordenados

Aurora kinase protein family in Trypanosoma cruzi: Novel role of an AUK-B homologue in kinetoplast replication.

Aurora kinases constitute a family of enzymes that play a key role during metazoan cells division, being involved in events like centrosome maturation and division, chromatin condensation, mitotic spindle assembly, control of kinetochore-microtubule attachments, and cytokinesis initiation. In this work, three Aurora kinase homologues were identified in Trypanosoma cruzi (TcAUK1, -2 and -3), a protozoan parasite of the Kinetoplastida Class. The genomic organization of these enzymes was fully analyzed, demonstrating that TcAUK1 is a single-copy gene, TcAUK2 coding sequence is present in two different forms (short and long) and TcAUK3 is a multi-copy gene. The three TcAUK genes are actively expressed in the different life cycle forms of T. cruzi (amastigotes, trypomastigotes and epimastigotes). TcAUK1 showed a changing localization along the cell cycle of the proliferating epimastigote form: at interphase it is located at the extremes of the kinetoplast while in mitosis it is detected at the cell nucleus, in close association with the mitotic spindle. Overexpression of TcAUK1 in epimastigotes leaded to a delay in the G2/M phases of the cell cycle due a retarded beginning of kinetoplast duplication. By immunofluorescence, we found that when it was overexpressed TcAUK1 lost its localization at the extremes of the kinetoplast during interphase, being observed inside the cell nucleus throughout the entire cell cycle. In summary, TcAUK1 appears to be a functional homologue of human Aurora B kinase, as it is related to mitotic spindle assembling and chromosome segregation. Moreover, TcAUK1 also seems to play a role during the initiation of kinetoplast duplication, a novel role described for this protein

Genomic organization of TcAUKs genes.

(A) Southern blot with TcAUKs probes and genomic DNA of T. cruzi digested with restriction endonucleases with target sites outside the TcAUK genes, and with one (1) or two (2) restriction site inside the sequence of the corresponding TcAUK gene. Asterisks at PstI line indicate the four obtained bands. (B) Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) of T. cruzi epimastigotes probed against each one of the TcAUK genes.</p

Effect of TcAUK1 overexpression on cell cycle progression in epimastigotes.

(A) Mitotic progression of pTREX and pTREX-TcAUK1 synchronized cells was monitored by flow cytometry, measuring DNA content every 30 min between hours 11 to 14 post-releasing. (B) Mitotic spindle dynamics and DNA structure duplication (nucleus and kinetoplast) in WT cells were observed by immunostaining with mouse KMX-1 monoclonal antibody and DAPI dye, respectively. In the schematic representation of the events captured by microscopy: green is the mitotic spindle, blue the nucleus and dark blue the kinetoplast; NF means new flagellum and FP is flagellar pocket. (C) Graphical representation of cells with different number of flagellum (F), nucleus (N) and kinetoplast (K) in synchronized control (pTREX) and overexpression cells (pTREX-TcAUK1) at different time points after realizing (11 to 14 hs). Data are presented as the percentage of over 200 cells counted. (D) Mitotic spindle assembling (yellow arrows) and flagellum duplication in TcAUK1 overexpressing cells by immunostaining with mouse monoclonal KMX-1 antibody. Cell’s nucleus and kinetoplast (red arrows) were counterstained with DAPI.</p