The Role of Nonheme Transition Metal-Oxo, -Peroxo, and -Superoxo Intermediates in Enzyme Catalysis and Reactions of Bioinspired Complexes

Transition metals are common cofactors in enzymes and enable catalysis to take place via reaction barriers that are accessible at room temperature. Oxygen-activating metalloenzymes are versatile species in Nature involved in vital processes ranging from biodegradation to biosynthesis. Since oxygen-activating intermediates are not readily amenable to experimental study, research has started to focus on biomimetic model systems that have the active site coordination sphere and structural features, but react in solution. In our research group, we have been involved in computational modeling of heme and nonheme iron dioxygenases as well as biomimetic models of these complexes. In this contribution, an overview is given on recent results of the characterization and reactivity patterns of metal-oxo, metal-peroxo, and metal-superoxo complexes. In particular, in recent studies attempts were made to trap and characterize the short-lived oxygen-bound intermediate in the catalytic cycle of cysteine dioxygenase. Many suggested structures could be ruled out by theoretical considerations, yet these also provided suggestions of possible candidates for the experimentally observed spectra. In addition, we review recent studies on the nonheme iron(III)-hydroperoxo species and how its reactivity patterns with arenes are dramatically different from those found for heme iron(III)-hydroperoxo species. In the final two sections there is a description, with illustrations, of a series of computational studies on manganese(V)-oxo and side-on manganese(III)-peroxo moieties that identify a unique spin-state reactivity pattern with a surprising product distribution.</p

Investigation of Toll-like receptors in pancreatic cancer, renal cell carcinoma and colorectal carcinoma

Die dauerhafte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-&#312;B führt zu einem inflammatorischen Reiz, der für die Entstehung und Progression von Tumoren von großer Bedeutung ist. In diesem Zusammenhang wurde das Expressionsmuster von Toll-like Rezeptoren stadienabhängig für das Pankreas- und Nierenzellkarzinom sowie das kolorektale Karzinom analysiert. Die Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit weisen auf eine besondere Rolle bei der Tumorprogression durch Toll-like Rezeptoren hin. Diese Arbeit zeigt, dass TLRs nicht nur wie bislang beschrieben, die humorale Immunantwort stimulieren, sondern durch Expression auf oder in Tumorzellen Einfluss auf das weitere Tumorwachstum nehmen können. Die Daten lassen damit schlussfolgern, dass je nach Tumorgewebe Toll-like Rezeptoren unterschiedlich stark exprimiert werden und eine bisher wenig berücksichtigte Kausalität hinsichtlich der Tumorprogression vermuten lassen. Eine virale Pathogenese durch das Genom per se in Interaktion mit den TLRs sei besonders bei Progression des Pankreaskarzinoms durch TLR7 und TLR8 vermutet. Eine ähnliche Kausalität bei Progression sei vor allem durch Interaktion viraler Genome mit TLR7, TLR8 und TLR9 beim kolorektalen Karzinom vermutet. Die Aktivierung von TLR7, TLR8 und TLR9 scheint beim Nierenzellkarzinom ebenfalls eine Rolle zu spielen. Auch ein bakterieller Faktor bei Tumorprogression kann vermutet werden. Diese Ergebnisse weisen auf eine Kombination einer bakteriellen und viralen Pathogenese beim Pankreaskarzinom hin und liefern somit eine mögliche mitbegründende Kausalität für die schlechte Prognose und rasche Progression dieses bösartigsten Tumors. Der chronische Entzündungsreiz stellt einen außerordentlich wichtigen Prozess bei Tumorprogression dar. Diese mit der Zielsetzung der Arbeit verbundenen Erkenntnisse weisen neue Wege für die Tumortherapie auf, einen chronischen Entzündungsprozess durch Blockierung von Toll-like Rezeptoren zu unterbinden. Somit könnten Wachstum, Neoangiogenese und Metastasierung möglicherweise verlangsamt oder sogar verhindert werden. Die Therapie maligner Erkrankungen mit herkömmlichen zytostatischen Methoden zielt vorwiegend auf die stoffwechselabhängigen Vorgänge der Zellproliferation ab. Es befindet sich aber nur ein relativ kleiner Anteil aller Tumorzellen in einer Proliferationsphase. Die Entdeckung und Differenzierung zellständiger, tumorassoziierter Antigene und die Herstellung spezifischer Antikörper stellt in diesem Zusammenhang ein neuartiges, zellphasenunabhängiges Wirkprinzip dar. Das lässt auf eine effektivere und nebenwirkungsärmere Tumortherapie hoffen. Bei verschiedenen Tumorerkrankungen erweist sich die Immuntherapie mit Antikörpern zunehmend als eine erfolgsversprechende Therapieform. Sie hat sich mittlerweile neben den herkömmlichen Behandlungsansätzen, der Operation, Chemotherapie und Bestrahlung, als vierte Säule fest etabliert. Insbesondere beim kolorektalen Karzinom sowie bei Lymphomen entwickelte sich die immunologische Tumortherapie in den letzten Jahren von der experimentellen Phase zu einer Standardtherapie. Da die Expression von Toll-like Rezeptoren auf Tumoren, wie in der vorliegenden Arbeit gesehen, stark hochreguliert ist und eine vergleichsweise geringe Expression auf Normalgewebe ersichtlich war, eignen sich Toll-like Rezeptoren daher als potentielle Ziele für eine immunologische Tumortherapie mit monoklonalen Antikörpern.It is known, that inflammation and chronic infection are the most important epigenetic and environmental factors leading to tumorigenesis and tumor progression. Nuclear factor-kappaB (NF-&#954;B) appears as a key player for the synthesis of pro-inflammatory chemokines and cytokines. In this study the expression of Toll-like Receptor (TLR) in pancreas, renal cell, and colorectal carcinoma was analyzed dependent on the stage of the disease. This is the first study describing TLR expression within the pancreatic, renal cell and colorectal tumor. The TLR family is a family of receptors involved in microbial recognition by the innate immune system, which is thought to promote tumor growth through inflammation-dependent mechanisms. Recognition of bacterial and/or viral products by innate immune cells may induce an inflammatory response associated with tumor progression. We analyzed the gene and protein expression of the TLRs in pancreatic cancer, renal cell, and colorectal carcinoma and compared with normal tissues. An increased expression of TLR7, TLR8, and TLR9 was detected at later tumor stages (UICC III/IV). compared with early tumor stages (UICC I/II) Our data suggest that a targeted therapy using a blockade of TLRs might help tumor patients suffering from chronic infection and/or cancer disease with low prognose of convalescence

Aktivierung von Peroxiden an Modellsystemen für Cytochrom P450

Although there are generally accepted consensus mechanisms that provide a detailed picture of the processes in the catalytic cycle of cytochrome P450 and the mechanistic steps for the reaction of its intermediates with substrates, many of these aspects are still not clarified in detail. The aim of this work was to contribute to a general understanding of these processes with the help of kinetic methods and spectroscopic techniques, such as low-temperature stopped-flow UV/Vis measurements. In this context, a very basic challenge was to find a way to selectively produce analogues for the key intermediates occurring in the catalytic cycle of cytochrome P450. Although Cpd I is generally accepted as the most crucial intermediate in P450 catalysis, there is still a fundamental controversy among scientists about the influence of Cpd 0 under catalytic conditions. If Cpd 0 could play a role as a second oxygenating agent in addition to Cpd I, this would help to explain product distributions found for example in iron porphyrin catalyzed epoxidation reactions. To clarify this question, direct kinetic studies on epoxidation and sulfoxidation reactions by Cpd 0 and Cpd I were carried out. Under catalytic turnover conditions, where the substrate is present in the reaction medium right from the start of the catalytic cycle, the scenario is slightly different: In this case not only the relative ratio kCpd I / kCpd 0 plays a decisive role in the substrate oxidation competition between Cpd 0 and Cpd I. Intermediately formed Cpd 0 can either transfer oxygen to the substrate (kCpd 0) or it can undergo heterolytic O-O bond cleavage to produce the significantly more active Cpd I (khet), which subsequently also reacts with the substrate (kCpd I). Although the O-O bond cleavage is the rate-determining step in the formation of Cpd I, the rate constants for this reaction step are still orders of magnitude higher than those for the reaction of Cpd 0 with the substrate. Based on the observed rate constants determined for each reaction step, it can be calculated that only at a ca. 5000 fold excess concentration of cis-stilbene in reference to the porphyrin complex, cis-stilbene oxygenation by Cpd 0 can compete with the heterolytic O-O bond cleavage under the selected conditions.This first experimental evidence is in line with the results of recent theoretical calculations identifying two-state or multi-state reactivity patterns instead of a contribution of Cpd 0 as the reason for the observed product distributions. Subsequently, the exceptional possibility to selectively produce, identify and stabilize Cpds 0, I and II in solution was used to carry out direct kinetic studies on the reactivity of these intermediates in epoxidation, sulfoxidation, O-H abstraction, C-H abstraction and hydride transfer reactions with different. Regardless of the fact that the outstanding reactivity of Cpd I could be confirmed, Cpd II turned out to be the most efficient catalyst for hydride transfer reactions. This type of reaction can be described as a hydrogen atom transfer process regarded as a proton-coupled electron transfer (PCET). Although the reactivity order in this type of reaction (viz. Cpd II > Cpd 0 > Cpd I) might be surprising at first sight, it can be easily explained as a consequence of the ability of each reactive intermediate to promote the rate-determining proton abstraction step. Furthermore, a significantly different behaviour of Cpd 0 and Cpd II in epoxidation or sulfoxidation reactions compared to C-H abstraction reactions could be demonstrated. As expected, in C-H abstraction reactions the reactivity order depends on the charge of the iron center, viz. Cpd I >> Cpd II > Cpd 0. In contrast, Cpd 0 is a more effective catalyst than Cpd II in epoxidation and sulfoxidation reactions, because the latter are two-electron processes and Cpd II is (unlike Cpd 0) only a one-electron oxidant. For further clarification of the underlying effects influencing the reactivity in epoxidation and C-H abstraction reactions of Cpds I and II, the first comparative study to evaluate thermal activation parameters was performed. Epoxidation reactions are clearly enthalpy-controlled, whereas C-H abstraction reactions can in many cases be dominated by factors contributing to the activation entropy. Since an important impact of the activation entropy contribution leads to a significant dependence of the activation barrier on the temperature, it can be assumed that a close correlation between bond strength and reaction rate - as commonly assumed for C-H abstraction reactions - is no longer at hand. In this respect, also theoretical calculations using the activation energy (Ea) instead of ΔG≠ as a measure for the activation barrier have to be interpreted with caution, because Ea is independent of temperature.Obwohl es allgemein anerkannte Konsensmechanismen gibt, die sowohl die chemischen Vorgänge im Katalysezyklus von Cytochrom P450, als auch die Reaktionen der dort auftretenden Intermediate mit Substraten umfassend beschreiben, sind viele Einzelheiten bisher nicht geklärt. Das Ziel dieser Arbeit war es, einen wichtigen Beitrag zum generellen Verständnis dieser Prozesse mit Hilfe kinetischer Untersuchungen und spektroskopischer Methoden – z. B. durch tieftemperatur Stopped-flow Messungen – zu leisten. In diesem Zusammenhang war die grundlegende Herausforderung, eine Möglichkeit zu entwickeln, die Schlüsselintermediate des Katalysezyklus von Cytochrom P450 selektiv herzustellen, zu identifizieren und in Lösung zu stabilisieren. Obwohl Cpd I allgemein als reaktivstes dieser Intermediate gilt, gibt es nach wie vor unterschiedliche Ansichten über den Einfluss von Cpd 0 unter katalytischen Bedingungen. Sollte Cpd 0 als zweites Oxygenierungsmittel neben Cpd I eine Rolle spielen, könnten dadurch Produktverteilungen erklärt werden, wie sie z.B. bei von Eisenporphyrinen katalysierten Epoxidierungen beobachtet werden. Zur Klärung dieser Frage wurden direkte kinetische Untersuchungen der Epoxidierung und der Sulfoxidation durch Cpd 0 und I durchgeführt. Unter Katalysebedingungen – wenn also das Substrat schon zu Beginn des Katalysezyklus in Lösung vorhanden ist – ist nicht nur das relative Verhältnis kCpd I / kCpd 0 für die Konkurrenz zwischen Cpd 0 und I bei der Oxidation des Substrates von Belang. Intermediär gebildetes Cpd 0 kann entweder Sauerstoff auf das Substrat übertragen (kCpd 0), oder es wandelt sich durch den heterolytischen Bruch der O-O-Bindung in das deutlich reaktivere Cpd I um (khet), das dann seinerseits mit dem Substrat reagiert (kCpd I). Obwohl die O-O-Bindungsspaltung bei der Bildung von Cpd I geschwindigkeitsbestimmend ist, sind die Geschwindigkeitskonstanten für diesen Schritt immer noch um mehrere Zehnerpotenzen größer, als die für die Reaktion von Cpd 0 mit dem Substrat. Auf der Grundlage der beobachteten Geschwindigkeitskonstanten für jeden dieser Reaktionsschritte kann berechnet werden, dass unter den gewählten Bedingungen nur bei einem etwa 5000fachen Überschuss von cis-Stilben bezogen auf die Porphyrinkonzentration die Oxygenierung von cis-Stilben durch Cpd 0 mit dem heterolytischen O-O-Bindungsbruch konkurrieren kann. Dieser erste experimentelle Beweis deckt sich mit den Ergebnissen theoretischer Berechnungen, die nicht einen Einfluss von Cpd 0 als Grund für Produktverteilungen ansehen, sondern two-state bzw. multi-state Modelle postulieren. Anschließend wurden direkte kinetische Untersuchungen der Reaktivität dieser Intermediate bei Epoxidierungen, Sulfoxidierungen, O-H und C-H Abstraktionen und bei Hydrid-Transfer-Reaktionen mit verschiedenen Intermediaten untersucht. Unabhängig von der Tatsache, dass die herausragende Reaktivität von Cpd I im Allgemeinen bestätigt werden konnte, hat sich herausgestellt, dass Cpd II der effizienteste Katalysator bei Hydrid-Transfer-Reaktionen ist. Dieser Reaktionstypus kann als Transfer eines Wasserstoffatoms angesehen werden, der über einen an eine Protonenübertragung gekoppelten Elektronentransfer-Mechanismus (PCET) verläuft. Obwohl die Reihenfolge der Reaktivität (Cpd II > Cpd 0 > Cpd I) auf den ersten Blick überrascht, kann sie doch leicht als Folge der Fähigkeit des jeweiligen Intermediats erklärt werden, die geschwindigkeitsbestimmende Protonenabstraktion durchzuführen. Weiterhin wurde bei Epoxidierungen und Sulfoxidationen ein anderes Verhalten von Cpd 0 und I festgestellt, als es bei C-H Abstraktionen zu beobachten ist. Erwartungsgemäß steigt die Reaktivität bei C-H Abstraktionen mit der Ladung des Eisenzentrums, also Cpd I >> Cpd II > Cpd 0. Im Gegensatz dazu ist bei Epoxidierungen und Sulfoxidationen Cpd 0 ein effektiverer Katalysator als Cpd II, da diese Reaktionen 2e--Prozesse sind, aber Cpd II anders als Cpd 0 nur ein Einelektronen-Oxidationsmittel ist. Zur genaueren Untersuchung der zugrundeliegenden Einflüsse auf die Reaktivität bei Epoxidierungen und C-H Abstraktionen von Cpd I und II wurde die erste vergleichende Studie zur Bestimmung der thermischen Aktivierungsparameter durchgeführt. Die untersuchten Epoxidierungen verlaufen eindeutig enthalpiekontrolliert, wogegen C-H-Abstraktionen in vielen Fällen von Faktoren dominiert sein können, die der Aktivierungsentropie zuzuschreiben sind. Da ein großer Beitrag der Aktivierungsentropie zu einer signifikanten Temperaturabhängigkeit der Aktivierungsbarriere führt, ist davon auszugehen, dass ein enger Zusammenhang zwischen der C-H-Bindungsstärke und der Reaktionsgeschwindigkeit, wie er üblicherweise für C-H-Abstraktionen angenommen wird, nicht mehr gegeben ist. Aufgrund dieser Erkenntnis müssen auch theoretische Berechnungen hinterfragt werden, die statt auf ΔG≠ auf der Aktivierungsenergie (Ea) basieren, da letztere eine temperaturunabhängige Größe ist