4’-Phosphopantethein Transfer in Bacillus subtilis und Pseudomonas aeruginosa sowie Grundlagen zur gerichteten Proteinevolution von Adenylierungsdomänen der Nichtribosomalen Peptidsynthetasen

Carrier Proteine (CP) werden in unterschiedlichen prokaryontischen und eukaryontischen Synthesesystemen als Transporteinheiten für die Syntheseintermediate eingesetzt. Im Primärmetabolismus dienen sie zum Transport von Acyleinheiten (Fettsäuresynthese) und D-Ala (Modifikation der Zellwand). Im Sekundärmetabolismus werden sie zur Beförderung von Aminoacyl/Peptidyl/Aryleinheiten (nichtribosomale Peptidsynthetasen, NRPS) und Ketoacyleineheiten (Polyketidsynthasen) eingesetzt. Die Intermediate werden am 4’-Phosphopantethein-Cofaktor (4’PP) des CP als Thioester gebunden. Der 4’PP-Cofaktor wird posttranslational von Coenzym A auf einen konservierten Serinrest des CP übertragen, katalysiert durch sog. 4’PP-Transferasen (PPTasen). E. coli besitzt zwei PPTasen. Die Acyl Carrier Protein Synthase (AcpS) modifiziert nur die CP des Primärmetabolismus, während EntD nur die CP des Sekundärmetabolismus bedient. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die beiden PPTasen von B. subtilis, AcpS und Sfp, überlappende Spezifitäten besitzen. Es zeigte sich, dass AcpS lediglich die CP des Primärmetabolismus modifiziert, während Sfp, das zwar alle CP erkennt, jedoch deutliche Präferenz für die CP des Sekundärmetabolismus hat. In P. aeruginosa wurde nur eine PPTase, PcpS, gefunden. Aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften ist PcpS eine PPTase des Sekundärmetabolismus. Biochemische Untersuchungen zeigten, dass sie, wie Sfp, alle CP modifizieren kann, jedoch evolutiv auf die Modifikation der CP des Primärmetabolismus optimiert wurde. Eine Deletion des zugehörigen Gens und RNA-interference zeigten, dass diese PPTase für P. aeruginosa essentiell ist. Weitere Untersuchung zur CP-PPTasen-Erkennung konnten außerdem die Interaktionsstelle zwischen beiden Proteinen aufdecken. Die Inhibierung der Adenylierungsdomänen (A-Domänen) der NRPS, die für die Selektion des Aminosäuresubstrats verantwortlich sind, durch Aminoacyl-Sulfamoyl Adenylatanaloga konnte im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich auf eine A-Domäne des Primärmetabolismus übertragen werden. Ein Modifikation dieser Inhibitoren mit einem Linker erlaubt ihre Bindung an eine Matrix. Der Linker beeinflusst die inhibitorischen Eigenschaften z.T. nicht und kann den Einsatz dieser linkermodifizierten Inhibitoren zur gerichteten Proteinevolution von A-Domänen ermöglichen. Außerdem wurde zum Zweck der Evolution von A-Domänen ein Screeningsystem entwickelt. Dieses System basiert auf der in vivo beobachtbaren Lumineszenz der Luciferase. Damit kann eine A-Domänenbibliothek auf veränderte Selektivität in Richtung des Substrats der Luciferase, Luciferin, durchmustert werden

4’-Phosphopantethein Transfer in Bacillus subtilis und Pseudomonas aeruginosa sowie Grundlagen zur gerichteten Proteinevolution von Adenylierungsdomänen der Nichtribosomalen Peptidsynthetasen

Carrier Proteine (CP) werden in unterschiedlichen prokaryontischen und eukaryontischen Synthesesystemen als Transporteinheiten für die Syntheseintermediate eingesetzt. Im Primärmetabolismus dienen sie zum Transport von Acyleinheiten (Fettsäuresynthese) und D-Ala (Modifikation der Zellwand). Im Sekundärmetabolismus werden sie zur Beförderung von Aminoacyl/Peptidyl/Aryleinheiten (nichtribosomale Peptidsynthetasen, NRPS) und Ketoacyleineheiten (Polyketidsynthasen) eingesetzt. Die Intermediate werden am 4’-Phosphopantethein-Cofaktor (4’PP) des CP als Thioester gebunden. Der 4’PP-Cofaktor wird posttranslational von Coenzym A auf einen konservierten Serinrest des CP übertragen, katalysiert durch sog. 4’PP-Transferasen (PPTasen). E. coli besitzt zwei PPTasen. Die Acyl Carrier Protein Synthase (AcpS) modifiziert nur die CP des Primärmetabolismus, während EntD nur die CP des Sekundärmetabolismus bedient. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die beiden PPTasen von B. subtilis, AcpS und Sfp, überlappende Spezifitäten besitzen. Es zeigte sich, dass AcpS lediglich die CP des Primärmetabolismus modifiziert, während Sfp, das zwar alle CP erkennt, jedoch deutliche Präferenz für die CP des Sekundärmetabolismus hat. In P. aeruginosa wurde nur eine PPTase, PcpS, gefunden. Aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften ist PcpS eine PPTase des Sekundärmetabolismus. Biochemische Untersuchungen zeigten, dass sie, wie Sfp, alle CP modifizieren kann, jedoch evolutiv auf die Modifikation der CP des Primärmetabolismus optimiert wurde. Eine Deletion des zugehörigen Gens und RNA-interference zeigten, dass diese PPTase für P. aeruginosa essentiell ist. Weitere Untersuchung zur CP-PPTasen-Erkennung konnten außerdem die Interaktionsstelle zwischen beiden Proteinen aufdecken. Die Inhibierung der Adenylierungsdomänen (A-Domänen) der NRPS, die für die Selektion des Aminosäuresubstrats verantwortlich sind, durch Aminoacyl-Sulfamoyl Adenylatanaloga konnte im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich auf eine A-Domäne des Primärmetabolismus übertragen werden. Ein Modifikation dieser Inhibitoren mit einem Linker erlaubt ihre Bindung an eine Matrix. Der Linker beeinflusst die inhibitorischen Eigenschaften z.T. nicht und kann den Einsatz dieser linkermodifizierten Inhibitoren zur gerichteten Proteinevolution von A-Domänen ermöglichen. Außerdem wurde zum Zweck der Evolution von A-Domänen ein Screeningsystem entwickelt. Dieses System basiert auf der in vivo beobachtbaren Lumineszenz der Luciferase. Damit kann eine A-Domänenbibliothek auf veränderte Selektivität in Richtung des Substrats der Luciferase, Luciferin, durchmustert werden

Reduction of post injury neointima formation due to 17β-estradiol and phytoestrogen treatment is not influenced by the pure synthetic estrogen receptor antagonist ICI 182,780 in vitro

BACKGROUND: Animal and organ culture experiments have shown beneficial inhibitory estrogen effects on post injury neointima development. The purpose of this study was to investigate whether such estrogen effects are influenced by the estrogen receptor antagonist ICI 182,780. Different concentrations of 17β-estradiol and the phytoestrogens genistein and daidzein were tested. METHODS: F emale New Zealand White rabbits were benumbed. In situ vascular injury of the thoracic and abdominal aorta was performed by a 3F Fogarty catheter. Segments of 5 mm were randomised and held in culture for 21 days. Three test series were performed: 1) control group – 20 μM ICI – 30 μM ICI – 40 μM ICI. 2) control group – 20 μM ICI – 40 μM 17β-estradiol – 40 μM 17β-estradiol + 20 μM ICI. 3) control group – 20 μM ICI – 40 μM daidzein – 40 μM daidzein + 20 μM ICI – 20 μM genistein – 20 μM genistein + 20 μM ICI. After 21 days the neointima-media-ratio was evaluated. RESULTS: 1) Treatment with ICI 182,780 did not reduce neointima formation significantly (p = 0.05). 2) 40 μM 17β-estradiol alone (p < 0.0001) and in combination with 20 μM ICI (p < 0.0001) reduced neointima formation significantly. 3) 20 μM genistein alone (p = 0.0083) and combined with 20 μM ICI (p = 0.0053) reduced neointima formation significantly. 40 μM daidzein did not have a significant (p = 0.0637) effect. CONCLUSIONS: The estrogen receptor antagonist ICI 182,780 did not modulate the inhibitory estrogen effects on post injury neointima formation. These results do not support the idea that such effects are mediated by vascular estrogen receptors

Molecular richness and biotechnological potential of bacteria cultured from Irciniidae sponges in the north-east Atlantic

Several bioactive compounds originally isolated from marine sponges have been later ascribed or suggested to be synthesized by their symbionts. The cultivation of sponge-associated bacteria provides one possible route to the discovery of these metabolites. Here, we determine the bacterial richness cultured from two irciniid sponge species, Sarcotragus spinosulus and Ircinia variabilis, and ascertain their biotechnological potential. A total of 279 isolates were identified from 13 sponge specimens. These were classified into 17 genera - with Pseudovibrio, Ruegeria and Vibrio as the most dominant - and 3 to 10 putatively new bacterial species. While 16S rRNA gene sequencing identified 29 bacterial phylotypes at the 'species' level (97% sequence similarity), whole-genome BOX-PCR fingerprinting uncovered 155 genotypes, unveiling patterns of specimen-dependent occurrence of prevailing bacterial genomes across sponge individuals. Among the BOX-PCR genotypes recovered, 34% were active against clinically relevant strains, with Vibrio isolates producing the most active antagonistic effect. Several Pseudovibrio genotypes showed the presence of polyketide synthase (PKS) genes, and these were for the first time detected in isolates of the genus Aquimarina (Bacteroidetes). Our results highlight great biotechnological potential and interest for the Irciniidae sponge family and their diversified bacterial genomes.Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) [PTDC/MAR/101431/2008]; FCT [SFRH/BD/60873/2009, SFRH/BPD/62946/2009

Mycosporine-Like Amino Acids and Marine Toxins - The Common and the Different

Marine microorganisms harbor a multitude of secondary metabolites. Among these are toxins of different chemical classes as well as the UV-protective mycosporine-like amino acids (MAAs). The latter form a group of water-soluble, low molecular-weight (generally < 400) compounds composed of either an aminocyclohexenone or an aminocyclohexenimine ring, carrying amino acid or amino alcohol substituents. So far there has been no report of toxicity in MAAs but nevertheless there are some features they have in common with marine toxins. Among the organisms producing MAAs are cyanobacteria, dinoflagellates and diatoms that also synthesize toxins. As in cyclic peptide toxins found in cyanobacteria, amino acids are the main building blocks of MAAs. Both, MAAs and some marine toxins are transferred to other organisms e.g. via the food chains, and chemical modifications can take place in secondary consumers. In contrast to algal toxins, the physiological role of MAAs is clearly the protection from harmful UV radiation by physical screening. However, other roles, e.g. as osmolytes and antioxidants, are also considered. In this paper the common characteristics of MAAs and marine toxins are discussed as well as the differences

Cyclopiazonic Acid Biosynthesis of Aspergillus flavus and Aspergillus oryzae

Cyclopiazonic acid (CPA) is an indole-tetramic acid neurotoxin produced by some of the same strains of A. flavus that produce aflatoxins and by some Aspergillus oryzae strains. Despite its discovery 40 years ago, few reviews of its toxicity and biosynthesis have been reported. This review examines what is currently known about the toxicity of CPA to animals and humans, both by itself or in combination with other mycotoxins. The review also discusses CPA biosynthesis and the genetic diversity of CPA production in A. flavus/oryzae populations

The Natural Product Domain Seeker NaPDoS: A Phylogeny Based Bioinformatic Tool to Classify Secondary Metabolite Gene Diversity

New bioinformatic tools are needed to analyze the growing volume of DNA sequence data. This is especially true in the case of secondary metabolite biosynthesis, where the highly repetitive nature of the associated genes creates major challenges for accurate sequence assembly and analysis. Here we introduce the web tool Natural Product Domain Seeker (NaPDoS), which provides an automated method to assess the secondary metabolite biosynthetic gene diversity and novelty of strains or environments. NaPDoS analyses are based on the phylogenetic relationships of sequence tags derived from polyketide synthase (PKS) and non-ribosomal peptide synthetase (NRPS) genes, respectively. The sequence tags correspond to PKS-derived ketosynthase domains and NRPS-derived condensation domains and are compared to an internal database of experimentally characterized biosynthetic genes. NaPDoS provides a rapid mechanism to extract and classify ketosynthase and condensation domains from PCR products, genomes, and metagenomic datasets. Close database matches provide a mechanism to infer the generalized structures of secondary metabolites while new phylogenetic lineages provide targets for the discovery of new enzyme architectures or mechanisms of secondary metabolite assembly. Here we outline the main features of NaPDoS and test it on four draft genome sequences and two metagenomic datasets. The results provide a rapid method to assess secondary metabolite biosynthetic gene diversity and richness in organisms or environments and a mechanism to identify genes that may be associated with uncharacterized biochemistry

Diversity of Nonribosomal Peptide Synthetases Involved in the Biosynthesis of Lipopeptide Biosurfactants

Lipopeptide biosurfactants (LPBSs) consist of a hydrophobic fatty acid portion linked to a hydrophilic peptide chain in the molecule. With their complex and diverse structures, LPBSs exhibit various biological activities including surface activity as well as anti-cellular and anti-enzymatic activities. LPBSs are also involved in multi-cellular behaviors such as swarming motility and biofilm formation. Among the bacterial genera, Bacillus (Gram-positive) and Pseudomonas (Gram-negative) have received the most attention because they produce a wide range of effective LPBSs that are potentially useful for agricultural, chemical, food, and pharmaceutical industries. The biosynthetic mechanisms and gene regulation systems of LPBSs have been extensively analyzed over the last decade. LPBSs are generally synthesized in a ribosome-independent manner with megaenzymes called nonribosomal peptide synthetases (NRPSs). Production of active-form NRPSs requires not only transcriptional induction and translation but also post-translational modification and assemblage. The accumulated knowledge reveals the versatility and evolutionary lineage of the NRPSs system. This review provides an overview of the structural and functional diversity of LPBSs and their different biosynthetic mechanisms in Bacillus and Pseudomonas, including both typical and unique systems. Finally, successful genetic engineering of NRPSs for creating novel lipopeptides is also discussed