An overview of microRNAs as biomarkers of ALS

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS; MND, motor neuron disease) is a debilitating neurodegenerative disease affecting 4.5 per 100,000 people per year around the world. There is currently no cure for this disease, and its causes are relatively unknown. Diagnosis is based on a battery of clinical tests up to a year after symptom onset, with no robust markers of diagnosis or disease progression currently identified. A major thrust of current research is to identify potential non-invasive markers (“biomarkers”) in body fluids such as blood and/or cerebrospinal fluid (CSF) to use for diagnostic or prognostic purposes. Non-coding RNAs (ncRNAs), including microRNAs (miRNAs), are found at detectable and stable levels in blood and other bodily fluids. Specific ncRNAs can vary in levels between ALS patients and non-ALS controls without the disease. In this review, we will provide an overview of early findings, demonstrate the potential of this new class as biomarkers, and discuss future challenges and opportunities taking this forward to help patients with ALS

Serum miRNAs miR-206, 143-3p and 374b-5p as potential biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis (ALS)

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal, neurodegenerative condition characteris loss of motor neurones and progressive muscle wasting. There is no diagnostic test fo therefore robust biomarkers would not only be valuable for diagnosis, but also the classification of disease subtypes, monitoring responses to drugs and tracking diseas progression. As regulators of gene expression, microRNAs (miRNAs) are increasingly for diagnostic and prognostic purposes in various disease states with increasing explo in neurodegenerative disorders. We hypothesise that circulating blood based miRNAs serve as biomarkers and use miRNA profiling to determine miRNA signatures from th serum of sporadic (sALS) patients compared to healthy controls and patients with dise that mimic ALS. A number of differentially expressed miRNAs were identified in each patient comparisons. Validation in an additional patient cohort showed that miR-206 a miR-143-3p were increased and miR-374b-5p was decreased compared to controls. A continued change in miRNA expression persisted during disease progression indicatin potential use of these particular miRNAs as longitudinal biomarkers in ALS

Über den Schlaf von enuretischen Kindern und Jugendlichen, die mit dem Trizyklischen Antidepressivum Imipramin behandelt werden

Seit langem wird ein Zusammenhang zwischen nächtlichem Bettnässen und Schlaf vermutet. Innerhalb der letzten 150 Jahre entstanden zahlreiche Arbeiten über den Schlaf von Kindern mit einer Enuresis nocturna. Bis heute sind die Ergebnisse diskrepant und werden kon-trovers diskutiert. Häufig wurden in der Vergangenheit keine klaren Ein- bzw. Ausschlusskri-terien definiert bzw. befolgt; eine Unterscheidung zwischen verschiedenen Entitäten, deren Behandlungsformen oder Begleiterkrankungen fand häufig nicht statt. Aktuelle Ergebnisse haben gezeigt, dass sich die Betroffenen einer primären monosympto-matischen Enuresis nocturna (pMNE) mittels nichtinvasiver neuro-physiologischer Untersu-chungen des Startle-Reflexes in zwei grundverschiedene Gruppen aufteilen. Während die Mehrzahl eine deutlich reduzierte Präpulsinhibition (PPI) als Pendant für eine Reifungsver-zögerung des Startle-Reflexes aufweist, gibt es eine kleine Gruppe, welche sich durch eine im Vergleich zu gleichaltrigen Gesunden normale PPI auszeichnet. Auffällig ist das gute Ansprechen auf die „Standardtherapien“ derjenigen Enuretiker mit redu-zierter PPI, wohingegen die Betroffenen mit normaler PPI in Bezug auf diese Therapiefor-men refraktär sind und bislang nicht suffizient behandelt werden konnten. In der vorliegenden Arbeit wurden die aktuellen Erkenntnisse zur möglichen Unterscheidung der pMNE berücksichtigt und der Frage nachgegangen, ob es gerade diejenigen Enuretiker mit guter Reflexkontrolle sind, welche zusätzlich refraktär gegenüber den üblichen Therapien sind, die sich durch Besonderheiten im Schlaf auszeichnen. Hierzu wurde der Schlaf von 20 primären monosymptomatischen Enuretikern im Alter von 7 bis 24 Jahren, welche in Bezug auf die Standardtherapien mittels 1-Desamino-6-D-Arginin-Vasopressin (dDAVP), der Alarmtherapie oder der Kombination beider resistent sind und sich zusätzlich durch eine PPI oberhalb der Altersnorm auszeichnen, untersucht. In einem doppelblinden, randomisierten, Cross-over-Design fanden dreimalig ambulante Polysom-nographien zu definierten Zeitpunkten statt, wobei jeweils eine Probemessung sowie eine Messung unter Imipramin- resp. Placebo-Therapie stattfand. Neben der Schlafarchitektur und spezifischer Parameter wurde der Therapieerfolg unter Imipramin durch das Führen von Enuresis-Kalendern im Sinne der Reduktion nasser Nächte gemessen. Die Ergebnisse unterstreichen teilweise bekannte Beobachtungen: Das Einnässen findet nur ausnahmsweise im REM-Schlaf statt. Im nREM verteilen sich die Einnässereignisse in praktisch allen Schlafstadien. Die Reduktion der nassen Nächte unter Imipraminbehandlung wurde ebenfalls beschrieben. Bemerkenswert ist allerdings, dass es im Rahmen dieser Studie zu einer Verdopplung des bekannten Erfolgs kam. So kam es statt zur Verbesserung um eine trockene Nacht pro Wo-che (~0,14) zur Verbesserung um 3 trockene Nächte pro 10 Tage (0,3) – selbst unter einer sehr niedrig gewählten Dosierung. Unter Imipramingabe zeigen sich eine Verlängerung der REM-Latenz, eine Reduktion der REM-Schlaf-Anteile sowie eine Steigerung des Arousal-Index im REM-Schlaf. Auffällig ist die Häufung der von den Eltern berichteten schlechten Erweckbarkeit ihrer Kinder bei Einnässereignissen und in den Morgenstunden. Erstmalig ist damit eine Darstellung des unterschiedlichen Schlafes von Enuretikern gelun-gen. Allerdings kann nicht mit letzter Sicherheit ein Medikamenteneffekt durch Imipramin ausgeschlossen werden kann, weil die Testung an einer Kontrollgruppe ethisch nicht vertret-bar ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit bringen sowohl einen theoretischen Aspekt als auch einen praktischen Nutzen mit sich. Nachdem bei Enuretikern bislang zwischen einer primären und sekundären Form sowie zwischen monosymptomatischer und nicht-monosymptomatischer Entität unterschieden wurde, kann eine differenziertere Betrachtung erfolgen. Das Gros der Enuretiker – Betroffene mit primärer monosymptomatischen Enuresis – kann in zwei Entitä-ten unterschieden werden. Eine Gruppe zeichnet sich durch eine niedrige Präpulsinhibition (PPI) aus und kann erfolgreich mit den „Standardtherapien“ dDAVP und/oder Alarmtherapie behandelt werden. Eine weitere Gruppe fällt durch eine normale PPI auf und entspricht jenen vorher als therapieresistent eingestuften Enuretikern. Der praktische Nutzen liegt in der Mög-lichkeit, Betroffene letzterer Gruppe frühzeitig mittels PPI-Messung als nichtinvasives Verfah-ren zu selektieren und gezielter zu therapieren

Untersuchungen an einem zellfreien Proteinsynthesesystem basierend auf S30 Extrakten von Escherichia coli

Die zellfreie Proteinsynthese hat sich in den letzten Jahren zu einer wichtigen Methode der Proteinexpression entwickelt, die viele Vorteile gegenüber der in vivo Expression von Proteinen bietet. Ein Grund, warum die zellfreie Proteinsynthese die in vivo Expression noch nicht als Standardmethode zur Herstellung rekombinanter Proteine abgelöst hat, ist in der vergleichsweise geringen Produktivität dieser Systeme zu finden. Intensive Bemühungen der letzten Jahre konnten zwar die Ausbeute der zellfreien Proteinsynthese stark erhöhen, dennoch sind die erzielten Mengen noch weit von dem entfernt, was theoretisch möglich sein könnte. Aus diesem Grund wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene Ansätze verfolgt, die Ausbeute der zellfreien Proteinsynthese, am Beispiel eines Systems, das auf S30 Extrakten von Escherichia coli basiert, zu erhöhen. Darüber hinaus sollte dieses System als Teil eines von der GENEART AG entwickelten in vitro Evolutionssystems eingesetzt werden. Zu Beginn wurde ein Protokoll zur Herstellung der S30 Extrakte und zur Durchführung von zellfreien Proteinsynthesereaktionen optimiert, um ein solides und modernes Testsystem für weitere Versuche zur Verfügung zu haben. Dabei konnte sowohl der Zellaufschluss durch Sonifikation, als auch die Präinkubationsmethode als kritische Einflussfaktoren der Syntheseleistung identifiziert werden. Auch zeigte sich die Verwendung eines RNase E-defizienten E. coli Stammes für die Herstellung der Extrakte, sowie die Erhöhung der Konzentration an DTT in der Synthesereaktion als förderlich für die erzielten Proteinausbeuten. Insgesamt führten die Optimierungen zu der Etablierung eines Systems, dessen Produktivität nun sowohl mit den Systemen anderer Autoren, als auch mit kommerziell erhältlichen vergleichbar ist. Das optimierte zellfreie Proteinsynthesesystem sollte als Teil eines in vitro Evolutionssystems eingesetzt werden, wobei unter Anwesenheit der S30 Extrakte die Produktbildung einer reversen Transkriptase, die essentiell für eine Amplifikationsreaktion dieses Systems war, inhibiert wurde. Intensive Untersuchungen führten zu dem Schluss, dass zu viele Proteine in den S30 Extrakten, wie beispielsweise RNasen und DNA Polymerasen, dafür verantwortlich sind. Der Einsatz isolierter Ribosomen unterschiedlicher Reinheit war nicht möglich, da Translationsaktivität und Produktbildung der reversen Transkriptase nicht vereinbar schienen. Im Zusammenhang der Erhöhung der Produktivität konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Translationsmaschinerie in den S30 Extrakten optimal rekonstituiert ist. Dazu testete man alle Faktoren des Translationsapparates einzeln auf ihren Einfluss auf die Synthese eines Testproteins. Es wirkten sich jedoch nur die Elongationsfaktoren Tu und Ts positiv aus, wobei die Erhöhung der Syntheseleistung mit 13% bzw. 6% jedoch zu gering ausfiel, um von limitierenden Faktoren zu sprechen. Darüber hinaus wurden auch zellfreie Proteinsynthesereaktionen mit geringeren Konzentrationen an Translationsfaktoren durchgeführt. Jedoch konnte auch hier keine Steigerung der Syntheseleistung erzielt werden. Dies, zusammen mit den obigen Ergebnissen, erlaubt die Aussage der optimalen Rekonstitution der Translationsmaschinerie in S30 Extrakten von Escherichia coli. Desweiteren behandelte diese Arbeit das Problem der Sekundärstrukturbildung der mRNA, das mehrere Autoren als Grund für eine limitierte Proteinausbeute sehen. Durch den Einsatz der verschiedensten RNA Chaperone der unterschiedlichsten Klassen wurde versucht, auf die Translation inhibitorisch wirkende Sekundärstrukturen der mRNAs aufzulösen und diese Limitation zu überwinden, wodurch jedoch keine Steigerung der Syntheseleistung erreicht werden konnte. Die erstmalige Verwendung einer miRNA in einem zellfreien System, die durch Hybridisierung mit der 5‘ untranslatierten Region der mRNA regulatorische Sequenzen freilegen sollte, führte zu einer etwa 13%igen Steigerung der Syntheseleistung. Die größten Steigerungen der Syntheseleistung des zellfreien Systems aus E. coli erreichte man in dieser Arbeit durch die Erniedrigung der Reaktionstemperatur, wodurch unerwünschte Nebenreaktionen reduziert werden sollten. Dabei war der Einsatz der 5‘ untranslatierten Region eines Kälteschockgens nötig, um bei niedrigeren Temperaturen eine effiziente Proteinsynthese zu gewährleisten. Die Auswirkungen dieser 5‘ untranslatierten Region auf die zellfreie Expression mehrerer Proteine wurde getestet, wobei bei 60% sowohl eine erhöhte Ausbeute, beispielsweise 20% im Falle der Chloramphenicol Acetyltransferase, als auch eine einheitliche optimale Expressionstemperatur von 25°-30° C festgestellt werden konnte. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit mehrere vielversprechende Ansätze identifiziert werden, die Syntheseleisung von zellfreien Proteinsynthesesystemen aus E. coli zu verbessern, sowie einige bedeutende Hinweise zum besseren Verständnis dieser Methode geliefert werden

Therapeutic targeting of autophagy in neurodegenerative and infectious diseases.

Autophagy is a conserved process that uses double-membrane vesicles to deliver cytoplasmic contents to lysosomes for degradation. Although autophagy may impact many facets of human biology and disease, in this review we focus on the ability of autophagy to protect against certain neurodegenerative and infectious diseases. Autophagy enhances the clearance of toxic, cytoplasmic, aggregate-prone proteins and infectious agents. The beneficial roles of autophagy can now be extended to supporting cell survival and regulating inflammation. Autophagic control of inflammation is one area where autophagy may have similar benefits for both infectious and neurodegenerative diseases beyond direct removal of the pathogenic agents. Preclinical data supporting the potential therapeutic utility of autophagy modulation in such conditions is accumulating.We are grateful to the Wellcome Trust (095317/Z/11/Z Principal Research Fellowship to D.C. Rubinsztein and strategic award 100140), the National Institute for Health Research Biomedical Research Unit in Dementia at Addenbrooke’s Hospital (D.C. Rubinsztein), and the National Institutes of Health (AI042999 and AI111935; V. Deretic) for funding our work. D.C. Rubinsztein has received grant funding from MedImmune and is a scientific advisor for E3Bio and Bioblast.This is the final version. It was first published by Rockefeller University Press at http://jem.rupress.org/content/early/2015/06/17/jem.20150956.full

Protective paraspeckle hyper-assembly downstream of TDP-43 loss of function in amyotrophic lateral sclerosis

Background Paraspeckles are subnuclear bodies assembled on a long non-coding RNA (lncRNA) NEAT1. Their enhanced formation in spinal neurons of sporadic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) patients has been reported but underlying mechanisms are unknown. The majority of ALS cases are characterized by TDP-43 proteinopathy. In current study we aimed to establish whether and how TDP-43 pathology may augment paraspeckle assembly. Methods Paraspeckle formation in human samples was analysed by RNA-FISH and laser capture microdissection followed by qRT-PCR. Mechanistic studies were performed in stable cell lines, mouse primary neurons and human embryonic stem cell-derived neurons. Loss and gain of function for TDP-43 and other microRNA pathway factors were modelled by siRNA-mediated knockdown and protein overexpression. Results We show that de novo paraspeckle assembly in spinal neurons and glial cells is a hallmark of both sporadic and familial ALS with TDP-43 pathology. Mechanistically, loss of TDP-43 but not its cytoplasmic accumulation or aggregation augments paraspeckle assembly in cultured cells. TDP-43 is a component of the microRNA machinery, and recently, paraspeckles have been shown to regulate pri-miRNA processing. Consistently, downregulation of core protein components of the miRNA pathway also promotes paraspeckle assembly. In addition, depletion of these proteins or TDP-43 results in accumulation of endogenous dsRNA and activation of type I interferon response which also stimulates paraspeckle formation. We demonstrate that human or mouse neurons in vitro lack paraspeckles, but a synthetic dsRNA is able to trigger their de novo formation. Finally, paraspeckles are protective in cells with compromised microRNA/dsRNA metabolism, and their assembly can be promoted by a small-molecule microRNA enhancer. Conclusions Our study establishes possible mechanisms behind paraspeckle hyper-assembly in ALS and suggests their utility as therapeutic targets in ALS and other diseases with abnormal metabolism of microRNA and dsRNA

Advances, challenges and future directions for stem cell therapy in amyotrophic lateral sclerosis

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a rapidly progressive neurodegenerative condition where loss of motor neurons within the brain and spinal cord leads to muscle atrophy, weakness, paralysis and ultimately death within 3–5 years from onset of symptoms. The specific molecular mechanisms underlying the disease pathology are not fully understood and neuroprotective treatment options are minimally effective. In recent years, stem cell transplantation as a new therapy for ALS patients has been extensively investigated, becoming an intense and debated field of study. In several preclinical studies using the SOD1G93A mouse model of ALS, stem cells were demonstrated to be neuroprotective, effectively delayed disease onset and extended survival. Despite substantial improvements in stem cell technology and promising results in preclinical studies, several questions still remain unanswered, such as the identification of the most suitable and beneficial cell source, cell dose, route of delivery and therapeutic mechanisms. This review will cover publications in this field and comprehensively discuss advances, challenges and future direction regarding the therapeutic potential of stem cells in ALS, with a focus on mesenchymal stem cells. In summary, given their high proliferation activity, immunomodulation, multi-differentiation potential, and the capacity to secrete neuroprotective factors, adult mesenchymal stem cells represent a promising candidate for clinical translation. However, technical hurdles such as optimal dose, differentiation state, route of administration, and the underlying potential therapeutic mechanisms still need to be assessed

TBK1: a new player in ALS linking autophagy and neuroinflammation.

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is an adult-onset neurodegenerative disorder affecting motor neurons, resulting in progressive muscle weakness and death by respiratory failure. Protein and RNA aggregates are a hallmark of ALS pathology and are thought to contribute to ALS by impairing axonal transport. Mutations in several genes known to contribute to ALS result in deposition of their protein products as aggregates; these include TARDBP, C9ORF72, and SOD1. In motor neurons, this can disrupt transport of mitochondria to areas of metabolic need, resulting in damage to cells and can elicit a neuroinflammatory response leading to further neuronal damage. Recently, eight independent human genetics studies have uncovered a link between TANK-binding kinase 1 (TBK1) mutations and ALS. TBK1 belongs to the IKK-kinase family of kinases that are involved in innate immunity signaling pathways; specifically, TBK1 is an inducer of type-1 interferons. TBK1 also has a major role in autophagy and mitophagy, chiefly the phosphorylation of autophagy adaptors. Several other ALS genes are also involved in autophagy, including p62 and OPTN. TBK1 is required for efficient cargo recruitment in autophagy; mutations in TBK1 may result in impaired autophagy and contribute to the accumulation of protein aggregates and ALS pathology. In this review, we focus on the role of TBK1 in autophagy and the contributions of this process to the pathophysiology of ALS

Neurodegenerative Diseases and Autophagy

Most neurodegenerative diseases are characterized by the accumulation of aggregated proteins within neurons. These aggregate-prone proteins cause toxicity, a phenomenon that is further exacerbated when there is defective protein clearance. Autophagy is an intracellular clearance pathway that can clear these protein aggregates and has been shown to be beneficial in the treatment of neurodegenerative diseases in a variety of model systems. Here, we introduce the key components of the autophagy machinery and signaling pathways that control this process and discuss the evidence that autophagic flux may be impaired and therefore a contributing factor in neurodegenerative disease pathogenesis. Finally, we review the use of autophagy upregulation as a therapeutic strategy to treat neurodegenerative disorders