Engineering of a recombinant fab antibody fragment against cortisol

The paper dwells upon the molecular cloning of genes coding the structure of mouse immunoglobulins, which can specifically bind steroid hormone cortisol. For these purposes primers covering all families of genes, which code the structure ofimmunoglobulins G. Molecular-genetic constructions for effective expression of recombinant antibodies in cells of Escherichia coliwere constructed. Heterologous expression of Fab-fragments was performed. Recombinant protein has been isolated in homogenous state

Цитохромы Р450 как инструменты электроферментативного синтеза

The electrocatalytic properties of cytochrome P450 2C9 and the cytochrome P450 2C9/FAD and cytochrome P450 2C9/FMN complexes have been studied using a two-electrode system. The system consisted of an enzymatic catalyst electrode modified by the membrane-like compound didodecyldimethylammonium bromide (SPE/DDAB) and a measuring electrode, modified with carbon nanotubes (SPE/CNT). To study the effectiveness of electroenzymatic reactions catalyzed by cytochrome P450 2C9, the nonsteroidal anti-inflammatory drug diclofenac was used as a substrate. Cytochrome P450 2C9 catalyzes the stereospecific hydroxylation reaction to form 4′-hydroxydiclofenac. The metabolite 4′-hydroxydiclofenac was recorded at a potential E=+0.12 (relative to Ag/AgCl).The use of FAD and FMN as low-molecular mediators made it possible to increase the efficiency of electrocatalysis of the SPE/DDAB/CYP2C9/FAD system to 148±10% and SPE/DDAB/CYP2C9/FMN to 113±6% compared to SPE/DDAB/CYP2C9 (100±5%), and also increase the rate of the enzymatic reaction by 1.5 and 1.13 times, respectively.Для исследования электрокаталитических свойств цитохрома Р450 2С9 и комплексов цитохром P450 2C9/FAD и цитохром P450 2C9/FMN была использована двухэлектродная система, состоящая из ферментативного электрода- катализатора, модифицированного мембраноподобным соединением дидодецилдиметиламмоний бромидом (ПГЭ/ДДАБ), и измерительного электрода, модифицированного углеродными нанотрубками (ПГЭ/УНТ). Для исследования эффективности электроферментативных реакций, катализируемых цитохромом Р450 2С9, в качестве субстрата был использован нестероидный противовоспалительный лекарственный препарат диклофенак. Цитохром Р450 2С9 катализирует реакцию стереоспецифического гидроксилирования с образованием 4′-гидроксидиклофенака. Метаболит 4′-гидроксидиклофенак регистрировали при потенциале Е=0.12 (отн. Ag/AgCl). Использование FAD и FMN в качестве низкомолекулярного медиатора позволило увеличить эффективность электрокатализа системы ПГЭ/ДДАБ/CYP2С9/FAD до 148±10% и ПГЭ/ДДАБ/CYP2С9/FMN до 113±6% по сравнению с ПГЭ/ДДАБ/CYP2С9 (100±5%), а также увеличить скорость ферментативной реакции в 1.5 и 1.13 раза соответственно

Стратегия экспериментальных исследований интерактомики целевых белков

It is known that intermolecular interactions of proteins and peptides play a critical role in life processes. Such interactions can be either directly related to the implementation of various functions or play the role of a regulator. Currently, there is no doubt that the majority of proteins function as part of various molecular complexes, the formation of which occurs due to protein-protein interactions (PPIs), the totality of which can be defined as the “protein interactome”. Protein subinteractome studies are critical for studying the functions and regulatory mechanisms of unknown or poorly annotated proteins, understanding the architecture of intracellular molecular machines, and the design of PPI modulators. Previously, we used combinations of experimental approaches, as well as analytical and preparative methods, to study the subinteractomes of functionally different cellular proteins, which allowed us to identify the protein subinteractomes of several clinically significant human proteins. The purpose of this work was to conceptualize the principles of the experimental platform we developed for studying protein subinteractomes and to describe its features in detail.Известно, что межмолекулярные взаимодействия белков и пептидов играют важнейшую роль в процессах жизнедеятельности. Такие взаимодействия могут быть как напрямую связаны с осуществлением различных функций, так и играть роль регулятора. В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что большинство белков функционирует в составе различных молекулярных комплексов. Их формирование происходит за счёт белок-белковых взаимодействий (ББВ), совокупность которых можно определить как “белковый интерактом”. Исследования белковых субинтерактомов очень важны для изучения функций и механизмов регуляции неизвестных или плохо аннотированных белков, понимания архитектуры внутриклеточных молекулярных машин, а также дизайна модуляторов ББВ. Ранее мы применяли комбинации экспериментальных подходов, а также аналитических и препаративных методов для изучения субинтерактомов разных в функциональном отношении клеточных белков, что позволило идентифицировать белковые субинтерактомы некоторых клинически значимых белков человека. В данной работе мы интегрировали полученные ранее результаты в виде экспериментальной платформы, принципы которой представлены блок-схемами. Эти блок-схемы могут помочь широкому кругу читателей выполнить дизайн своих исследований в области изучения белковых субинтерактомов

Сравнение результатов SPR анализа взаимодействия антиген-антитело, выполненного с помощью биосенсоров Biacore X-100 («Cytiva», США) и MI-S200D («Inter-Bio», Китай)

Limited availability of Western scientific equipment, explains a growing need to switch to using scientific instruments made in China. This is especially true in the case of optical biosensors operating on the surface plasmon resonance (SPR) effect. However, comparability of experimental data obtained using Western and Chinese biosensors has not been investigated yet. In this work we have comparedresults of SPR analysis of the kinetics and affinity of interaction of IgG2a and IgG1 antibodies with protein A. Two biosensos Biacore X-100 (“Cytiva”, USA) and MI-S200D (“Inter-Bio”, China) have been used. It was shown that the values of the association rate constants obtained on both devices for two antibodies were close within one order of magnitude. For IgG1 antibodies, the dissociation rate constants were almost identical. Both devices provide high-quality data that are well described by a simple 1:1 model (Langmuir binding).В настоящее время в связи с ограничениями доступности западного научного оборудования растет актуальность перехода на использование научных приборов, произведенных в Китае. Сказанное в полной мере относится к оптическим биосенсорам, работающим на эффекте поверхностного плазмонного резонанса (SPR). При этом возникают вопросы о сопоставимости экспериментальных данных, полученных с помощью биосенсоров западного и китайского производства. В данной работе были сопоставлены результаты SPR-анализа кинетики и аффинности взаимодействия антител IgG2a и IgG1 с белком А, полученные с помощью биосенсоров Biacore X-100 («Cytiva», США) и MI-S200D («Inter-Bio», Китай). Было показало, что значения констант скорости ассоциации, полученных на обоих приборах для двух антител, близки в пределах одного порядка. Для антител IgG1 практически совпадают константы скорости диссоциации. Оба прибора дают высококачественные данные, которые хорошо описывались простой моделью 1:1 (Langmuir binding)

Сравнительный SPR анализ межмолекулярных взаимодействий с использованием оригинального чипа Biacore CM5 и его аналога CMD500M

Currently, users of Biacore SPR biosensors (“Cytiva”, USA) are faced with sanctions restrictions on the purchase of consumables (primarily optical chips) for this type of equipments. In this regard, the use of commercially available analogues of the optical chips has become relevant. In this work, a comparative study of molecular interactions was performed on a Biacore X100 SPR biosensor using an original Biacore CM5 optical chip (“Cytiva”, USA) and its analogue CMD500M (“XanTec bioanalytics GmbH”, Germany). Protein A was immobilized on both chips as a molecular ligand, often used in scientific research and biotechnological works to immobilize antibodies on various carriers (biosensor chips, sorbents, nano- and microparticles). An IgG antibody was used as a protein analyte. A comparative study of the interaction of various concentrations of antibodies with protein A immobilized on two versions of the chips was carried out. The values of the kinetic rate constants for the association (kon) and dissociation (koff) of complexes, as well as the equilibrium dissociation constant (Kd), were calculated from the obtained sensorgrams using the interaction model 1:1 (Langmuir) binding. The results of comparative measurements showed similar values of the rate constants and interaction affinities. The differences between the values of kon, koff and Kd were 18%, 10% and 9%, respectively. Thus, this study confirmed the interchangeability of the original SPR chips CM5 and their analogues CMD500M.В настоящее время пользователи SPR биосенсоров Biacore (“Cytiva”, США) столкнулись с санкционными ограничениями по закупке расходных материалов для данного оборудования, в первую очередь оптических чипов. В связи с этим стало актуальным использование их коммерчески доступных аналогов. В данной работе на SPR биосенсоре Biacore X100 было выполнено сравнительное исследование молекулярных взаимодействий с использованием оригинального оптического чипа Biacore CM5 (“Cytiva”) и его аналога CMD500M (“XanTec bioanalytics GmbH”, Германия). В качестве молекулярного лиганда на чипе был иммобилизован белок А, который часто используется в научных исследованиях и биотехнологических работах для иммобилизации антител на различных носителях (биосенсорные чипы, сорбенты, нано- и микрочастицы). В качестве белкового аналита был использован препарат антител типа IgG. Было выполнено сравнительное исследование взаимодействия различных концентраций антител с иммобилизованным на двух вариантах чипов белком А. Величины кинетических констант скоростей образования (kon) и распада (koff) комплексов, а также равновесной константы диссоциации комплекса (Kd), были рассчитаны из полученных наборов сенсограмм с использованием модели взаимодействия 1:1 (Langmuir) binding. Результаты сравнительных измерений показали близкие значения констант скоростей и аффинности взаимодействия (различия между величинами kon, koff и Kd составили 18%, 10% и 9% соответственно). Таким образом, данное исследование подтвердило практически полную взаимозаменяемость оригинальных SPR чипов CM5 и их аналогов CMD500M

Высокопроизводительный скрининг с помощью оптического SPR-биосенсора низкомолекулярных соединений на взаимодействие с CYP51 Candida krusei

The opportunistic fungus Candida krusei is the causative agent of nosocomial infections characterized by high mortality and development of resistance to drugs of the azole class. Therefore, develjoment of non-azole antifungal agents against resistant fungal strains is extremly important. Lanosterol 14-alpha demethylase (CYP51) is a well-known antifungal target. The optical SPR biosensor is a universal tool for screening studies in search of new drug prototypes. This paper presents the methodological aspects of high-hroughput SPR based screening of a library of low molecular weight compounds of natural origin for their interaction with C. krusei CYP51. It has been shown that when performing high-throughput screening, a researcher should pay special attention to the degree of a sensorgram curvature in the association phase. The described approaches to the analysis of high throughput screening data can be useful for researchers working with SPR biosensors from various manufacturers.Условно-патогенный гриб Candida krusei (C. krusei) является возбудителем нозокомиальных инфекций, характеризующихся высокой летальностью. В последнее время наблюдается тенденция к увеличению доли штаммов дрожжевых грибов, резистентных к препаратам класса азолов. Поэтому поиск потенциальных противогрибковых соединений неазольной природы является актуальным направлением исследований при разработке новых эффективных терапевтических средств в отношении резистентных штаммов грибов. Ланостерол 14-альфа деметилаза (CYP51) является широко известной мишенью для противогрибковых средств. Оптические SPR-биосенсоры представляют собой универсальный инструмент для скрининговых исследований, целью которых является поиск прототипов новых лекарственных соединений. В данной работе представлены методические аспекты высокопроизводительного скрининга библиотеки низкомолекулярных соединений природного происхождения, направленного на установление их взаимодействия с CYP51 C. krusei с использованием SPR-биосенсора. Как показывают результаты, при проведении высокопроизводительного скрининга особое внимание следует обращать на степень выраженности наклона сенсограммы взаимодействия в фазе ассоциации. Описанные подходы к анализу данных высокопроизводительного скрининга могут быть полезны исследователям, работающим с SPR-биосенсорами различных моделей

МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ, ГЕТЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ЭКСПРЕССИЯ И ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО СОМАТОТРОПИНА GALLUS GALLUS

Growth hormones (GH) are polypeptides that trigger different biochemical pathways. GH main function is to regulate anabolic and catabolic processes. GH also plays an important role as immunomodulator. In this paper, molecular cloning, heterological expression and purification of the recombinant G. gallus growth hormone have been conducted. Two biotechnological schemes have been developed: cytosol expression followed by inclusion bodies solubilisation and periplasmatic secretion. Expression levels of 2.43 and 15 mg per 1 liter of bacterial culture respectively were achieved. It has been shown that the best way of expression is periplasmatic secretion, which does not require complex solubilisation and refolding procedures and results in higher product yield and purity.Соматотропины относятся к группе полипептидных гормонов, запускающих различные каскады биохимиче­ских процессов. Основная функция соматотропина – влияние на анаболические и катаболические процессы орга­низма, а также иммуномодулирующая функция. В представленной работе проведено молекулярное клонирование, гетерологическая экспрессия и очистка рекомбинантного соматотропина Gallus gallus. Созданы две технологиче­ские схемы получения соматотропина: бактериальная экспрессия с последующей солюбилизацией телец включения и периплазматическая экспрессия соматотропина в бактериальных клетках. Выход целевого гормона составил 2,43 и 15 мг белка на литр культуральной среды соответственно. В работе показано, что наиболее оптимальной является стратегия периплазматической экспрессии, при которой нет необходимости в сложных процедурах солюбилизации и рефолдинга и получаемый белковый продукт характеризуется более высоким выходом и степенью очистки

Молекулярное клонирование, гетерологическая экспрессия и получение соматотропина человека

Growth hormone (GH) is a polypeptide produced in the anterior pituitary lobe that triggers different biochemical pathways and increases cell proliferation and growth. In this work, the pNic based vector for periplasmatic secretion was developed. Recombinant human growth hormone was produced via periplasmatic secretion (42h, 30 °С) followed by several steps of purification. GH obtained does not contain His-tag. Expression level of 2,85 mg per1 literof bacterial culture was achieved.Соматотропин – гормон пептидной природы, синтезирующийся в передней доле гипофиза и усиливающий пролиферацию клеток и рост организма. В результате проведенного исследования разработана конструкция для периплазматической экспрессии рекомбинантного соматотропина человека на основе плазмиды pNic, подобраны условия для периплазматической бактериальной экспрессии (42 ч, 30 °С), способы выделения и очистки препарата целевого белка, не содержащего гистидинового кластера. Получен препарат целевого белка высокой степени очистки и соответствующего природному по молекулярной массе (MW 22301,9 Да). Общее количество полученного рекомбинантного соматотропина человека составило 2,85 мг на литр среды

Особенности пробоподготовки лизатов для повышения эффективности выделения белковых партнеров целевых белков, кодируемых генами 18-ой хромосомы человека

The aim of this work was to test modifications of the standard protocol for the sample preparation of cell/tissue lysate before performing the affinity isolation of lysate protein partners for the target protein (bait protein) which is covalently immobilized on an inert sorbent (e.g. BrCN-, SH-Sepharose 4B) or a carrier (e.g. paramagnetic nanoparticles). The series of our previous works on applying the approach to direct molecular fishing procedure with combination of affinity chromatography and LC-MS/MS analysis using a number of proteins, encoded by the genes of human chromosome 18, have shown that there are at least two problems affecting the specificity and the effectiveness of this procedure. These include: (i) redundancy of the background proteins in the eluates from an affinity sorbent (carrier) due to isolation of multiprotein complexes “labeled” with a direct protein partner which binds with a bait protein immobilized on the sorbent; (ii) low enrichment of the eluates with appropriate protein partners due to the fact that some direct protein partners in the lysate exist in stable “wild type” complexes with the bait protein itself. This means that latter group of protein partners will not be sufficiently isolated from lysate. Therefore, in order to increase the specificity and efficiency of affinity isolation of protein partners for the bait protein, we modified the standard protocol of lysate preparation and the preliminary step on dissociation of lysate protein complexes was added. Several model experiments for the choice of regeneration solution, assessment of their efficiency in the dissociation of lysate protein complexes as well as the stability and binding capacity of proteins were performed under the control of surface plasmon resonance (SPR) biosensor Biacore 3000 using HepG2 cell lysate. It was shown that acid treatment and incubation of the cell lysate for one min on ice (final lysate dilution 20 times) and subsequent neutralization (pH shift from 2.0 to 7.4) resulted in maximal dissociation of the lysate protein complexes without significant negative effects on the protein-protein interactions tested.Целью работы было экспериментальное тестирование модификации стандартного протокола пробоподготовки клеточного/ тканевого лизата перед выполнением процедуры аффинного выделения из него белков-партнеров для целевого белка (белка-наживки), иммобилизованного на инертном сорбенте или парамагнитных наночастицах. Цикл наших предыдущих работ, посвященных прямому молекулярному фишингу с сопряжением хроматографических и масс-спектрометрических методов и технологии парамагнитных наночастиц c использованием ряда белков 18-ой хромосомы человека и также других белков показал, что существуют, по крайне мере, две проблемы, влияющие на специфичность и эффективность данной процедуры: (i) избыточность фоновых белков в элюатах с аффинного сорбента, обусловленная выделением мультибелковых комплексов, меченых прямым партнером, который связывается с целевым белком на сорбенте; (ii) низкая обогащенность элюатов белками-партнерами целевой группы обусловленная тем, что та или иная часть прямых белков-партнеров в лизате находится в составе стабильных комплексов «дикого типа» с самим белком-наживкой и не будет в достаточной степени выделена из лизата. Поэтому для повышения специфичности и эффективности аффинного выделения белков-партнеров целевого белка нами предложена модификация стандартной пробоподготовки, заключающаяся в предварительной диссоциации белковых комплексов лизата. Модельные эксперименты по выбору регенерационного раствора, оценке стабильности и связывающей способности белков при его воздействии, а также оценка эффективности диссоциации комплексов в лизате были выполнены под контролем оптического биосенсора Biacore 3000 («GE Healthcare», США) с использованием лизата клеточной культуры гепатокарциномы человека (HepG2) и рекомбинантных препаратов белков, кодируемых генами 18-ой хромосомы человека, Показано, что кислотная обработка разбавленного в 20 раз лизата с кратковременной экспозицией в течение 1 мин на льду и с последующей нейтрализацией (с рН 2.0 до рН 7.4) приводила к максимальной диссоциации белковых комплексов лизата, не оказывая существенного негативного влияния на тестируемые белок- белковые взаимодействия

Гетерологическая экспрессия, выделение и физико-химические свойства рекомбинантного цитохрома CYP1B1 человека

In order to study the catalytic properties of CYP1B1 toward a number of steroid compounds, we have developed an effective system of heterologous expression of hemoprotein in E.coli and isolated the preparation of recombinant CYP1B1 «soluble» form in a highly purified state. The interaction parameters of the purified enzyme with steroid ligands have been determined.С целью изучения каталитических свойств СYP1B1 по отношению к ряду стероидных соединений нами разработана эффективная система гетерологической экспрессиии гемопротеида в E.coli и выделен в высокоочищенном состоянии «растворимый» препарат рекомбинантного CYP1B1. Установлены параметры взаимодействия данного фермермента с стероидными лигандами