Sachbericht zum Verwendungsnachweis

Das AntiDEG-Projekt zielte auf die Identifizierung und Validierung von Proximitäts-basierten Wirkstoffen für den Abbau von Zielproteinen und toxischen Aggregaten zur pharmakologischen Modulation neurodegenerativer und neuroinflammatorischer Erkrankungen ab, für die es aktuell keine therapeutischen Lösungen gibt. Proximitäts-basierte Wirkstoffe sind hier PROTACs und andere molecular degraders, die spezifisch Schlüsselproteine adressieren, die bei Fehlregulation und Fehlfaltung toxische Eigenschaften entwickeln und letztlich zum Untergang von Neuronen und Gliazellen im Zentralnervensystem (ZNS) führen können. Diese pathophysiologischen Ereignisse treten beispielsweise bei der Multiplen Sklerose (MS) auf. MS ist dadurch harakterisiert, dass inflammatorische Ereignisse neuroaxonalen Schaden im ZNS herbeiführen können. Es gibt nur wenige Hinweise dafür, welche intrinsischen physiologischen Reaktionen in den Neuronen durch die Entzündung ausgelöst werden können. Aktuelle Daten zeigen allerdings, dass das synaptische Protein BSN (Bassoon) in neuronalen Somata von MS-Patienten akkumuliert. In einem MS-Krankheitsmodell in Mäusen, der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis, zeigte sich eine ähnliche Akkumulation des Proteins, welche durch eine Deletion des Bsn-Gens verhindert werden konnte. Interessanterweise konnte auch durch eine pharmakologische Aktivierung des Ubiquitin-Proteasom-Systems, und zwar durch eine Inhibition von Ubiquitin-abbauenden Enzymen (hier reversible Inhibition von USP14 mit IU1) der Akkumulation von Bsn und dem neuronalen Untergang entgegengewirkt werden. Somit scheint das Bsn-Zielprotein druggable im Kontext der Ubiquitin-abhängigen Degradation zu sein. An diesem Punkt wurde im Projekt AntiDEG angesetzt: Wir haben erprobt, ob BSN durch Proximität-basierende Wirkstoffe und Rekrutierung von spezifischen E3-Ubiquitin-Ligase-Komplexen ubiquitiniert und proteasomal abgebaut werden kann. Dafür wurden vor allem physiologisch relevante humane in vitro Zellmodelle etabliert und verwendet, um dies prinzipiell aufzuzeigen. Die Wirkung von PROTACs/molecular degraders wurde dabei unter anderem unter Verwendung von Ubiquitinierungs-blockierenden Bedingungen charakterisiert. Das AntiDEG-Projekt war eng mit ProxiDETECT zur Entwicklung geeigneter primärer Screening-Assays und BioDEL zu Strategien für die Überwindung von Körperbarrieren (Darm, Blut-Hirn-Schranke) verknüpft

PROXIDRUGS: Eine Assay- und Screeningplattform für Molecular Degraders (ProxiDETECT) - B

Das ProxiDETECT-Projekt zielte auf die Entwicklung einer vielseitigen Assay-, Screening- und molekularen Profilierungsplattform für die Identifizierung und Charakterisierung von molekularen Degradern in krankheitsrelevanten zellulären Systemen ab. Ein besonderer Schwerpunkt lag hierbei auf der Identifizierung von molecular glues und anderen monovalenten Proximitäts-induzierenden Wirkstoffen für die Behandlung von neuronalen Erkrankungen. Abbau-induzierende Moleküle wie PROTACs und molecular glue degrader (MGD) ermöglichen die gezielte Entfernung von Proteinen, die mit Krankheiten in Verbindung stehen, insbesondere von solchen, die als „undruggable“ gelten. Sie nutzen das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS), indem sie E3-Ligase und Zielprotein in direkte Nähe bringen, was zur Poly-Ubiquitinierung und zum Abbau des Zielproteins im Proteasom führt

Specific Inhibition of Phosphodiesterase-4B Results in Anxiolysis and Facilitates Memory Acquisition

Cognitive dysfunction is a core feature of dementia and a prominent feature in psychiatric disease. As non-redundant regulators of intracellular cAMP gradients, phosphodiesterases (PDE) mediate fundamental aspects of brain function relevant to learning, memory, and higher cognitive functions. Phosphodiesterase-4B (PDE4B) is an important phosphodiesterase in the hippocampal formation, is a major Disrupted in Schizophrenia 1 (DISC1) binding partner and is itself a risk gene for psychiatric illness. To define the effects of specific inhibition of the PDE4B subtype, we generated mice with a catalytic domain mutant form of PDE4B (Y358C) that has decreased ability to hydrolyze cAMP. Structural modelling predictions of decreased function and impaired binding with DISC1 were confirmed in cell assays. Phenotypic characterization of the PDE4BY358C mice revealed facilitated phosphorylation of CREB, decreased binding to DISC1, and upregulation of DISC1 and β-Arrestin in hippocampus and amygdala. In behavioural assays, PDE4BY358C mice displayed decreased anxiety and increased exploration, as well as cognitive enhancement across several tests of learning and memory, consistent with synaptic changes including enhanced long-term potentiation and impaired depotentiation ex vivo. PDE4BY358C mice also demonstrated enhanced neurogenesis. Contextual fear memory, though intact at 24 hours, was decreased at 7 days in PDE4BY358C mice, an effect replicated pharmacologically with a non-selective PDE4 inhibitor, implicating cAMP signalling by PDE4B in a very late phase of consolidation. No effect of the PDE4BY358C mutation was observed in the pre-pulse inhibition and forced swim tests. Our data establish specific inhibition of PDE4B as a promising therapeutic approach for disorders of cognition and anxiety, and a putative target for pathological fear memory

Reproducibility of molecular phenotypes after long-term differentiation to human iPSC-derived neurons: A multi-site omics study

Reproducibility in molecular and cellular studies is fundamental to scientific discovery. To establish the reproducibility of a well-defined long-term neuronal differentiation protocol, we repeated the cellular and molecular comparison of the same two iPSC lines across five distinct laboratories. Despite uncovering acceptable variability within individual laboratories, we detect poor cross-site reproducibility of the differential gene expression signature between these two lines. Factor analysis identifies the laboratory as the largest source of variation along with several variation-inflating confounders such as passaging effects and progenitor storage. Single-cell transcriptomics shows substantial cellular heterogeneity underlying inter-laboratory variability and being responsible for biases in differential gene expression inference. Factor analysis-based normalization of the combined dataset can remove the nuisance technical effects, enabling the execution of robust hypothesis-generating studies. Our study shows that multi-center collaborations can expose systematic biases and identify critical factors to be standardized when publishing novel protocols, contributing to increased cross-site reproducibility

Neurite Outgrowth Mediated by Translation Elongation Factor eEF1A1: A Target for Antiplatelet Agent Cilostazol

Cilostazol, a type-3 phosphodiesterase (PDE3) inhibitor, has become widely used as an antiplatelet drug worldwide. A recent second Cilostazol Stroke Prevention Study demonstrated that cilostazol is superior to aspirin for prevention of stroke after an ischemic stroke. However, its precise mechanisms of action remain to be determined. Here, we report that cilostazol, but not the PDE3 inhibitors cilostamide and milrinone, significantly potentiated nerve growth factor (NGF)-induced neurite outgrowth in PC12 cells. Furthermore, specific inhibitors for the endoplasmic reticulum protein inositol 1,4,5-triphosphate (IP3) receptors and several common signaling pathways (PLC-γ, PI3K, Akt, p38 MAPK, and c-Jun N-terminal kinase (JNK), and the Ras/Raf/ERK/MAPK) significantly blocked the potentiation of NGF-induced neurite outgrowth by cilostazol. Using a proteomics analysis, we identified that levels of eukaryotic translation elongation factor eEF1A1 protein were significantly increased by treatment with cilostazol, but not cilostamide, in PC12 cells. Moreover, the potentiating effects of cilostazol on NGF-induced neurite outgrowth were significantly antagonized by treatment with eEF1A1 RNAi, but not the negative control of eEF1A1. These findings suggest that eEF1A1 and several common cellular signaling pathways might play a role in the mechanism of cilostazol-induced neurite outgrowth. Therefore, agents that can increase the eEF1A1 protein may have therapeutic relevance in diverse conditions with altered neurite outgrowth

Molecular Imaging in Huntington's Disease

Huntington's disease (HD) is a rare monogenic neurodegenerative disorder caused by a trinucleotide CAG repeat expansion in the huntingtin gene resulting in the formation of intranuclear inclusions of mutated huntingtin. The accumulation of mutated huntingtin leads to loss of GABAergic medium spiny neurons (MSNs); subsequently resulting in the development of chorea, cognitive dysfunction and psychiatric symptoms. Premanifest HD gene expansion carriers, provide a unique cohort to examine very early molecular changes, occurring before the development of overt symptoms, to elucidate disease pathophysiology and identify reliable biomarkers of HD progression. Positron emission tomography (PET) is a non-invasive molecular imaging technique allowing the evaluation of specific molecular targets in vivo. Selective PET radioligands provide invaluable tools to investigate the role of the dopaminergic system, brain metabolism, microglial activation, phosphodiesterase 10A, and cannabinoid, GABA, adenosine and opioid receptors in HD. PET has been employed to monitor disease progression aiming to identify a reliable biomarker to predict phenoconversion from premanifest to manifest HD.</p

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