Feasibility Trial Intervention “Let’s Move Away From Screen”

“Let’s Move Away From Screen” was a six-week quality improvement project implemented in one of West Michigan’s after school programs among students attending 6th and 7th grades. The purpose was to implement physical activity and health education (nutrition, physical activity, and recreational screen time) with major intentions to (a) establish healthy lifestyles and decrease recreational screen time in the after school program and (b) evaluate the project’s acceptability and sustainability by students, parents, volunteers, and the organization. The project’s need was driven by the health needs assessment conducted in February 2016 by the school’s health center. One of the biggest concerns identified was that 34% of students attending 4th and 5th grade in the identified public school at the time of the survey (and who entered 6th and 7th grades during 2017-2018 academic year) reported spending on average three and more hours per day on recreational screen time. The American Academy of Pediatrics recommends to limit recreational screen time use for children of school age and younger to no more than two hours per day. The literature review findings identified a multicomponent approach (nutrition, physical activity, and screen time) that addresses information to both parents and children to be the most effective when targeting a reduction in screen time. This project was based on a multicomponent evidence-based intervention called “Let’s Go.” The primary outcome of the project was students’ healthy lifestyles (nutrition, physical activity, and screen time). The secondary outcome was to determine the project’s acceptability and sustainability by students, parents, and the after school program’s staff. “Let’s Move Away From Screen” was successfully implemented in the after school program

One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots

Retrograde axonal transport of nerve growth factor (NGF) signals is critical for the survival, differentiation, and maintenance of peripheral sympathetic and sensory neurons and basal forebrain cholinergic neurons. However, the mechanisms by which the NGF signal is propagated from the axon terminal to the cell body are yet to be fully elucidated. To gain insight into the mechanisms, we used quantum dot-labeled NGF (QD-NGF) to track the movement of NGF in real time in compartmentalized culture of rat dorsal root ganglion (DRG) neurons. Our studies showed that active transport of NGF within the axons was characterized by rapid, unidirectional movements interrupted by frequent pauses. Almost all movements were retrograde, but short-distance anterograde movements were occasionally observed. Surprisingly, quantitative analysis at the single molecule level demonstrated that the majority of NGF-containing endosomes contained only a single NGF dimer. Electron microscopic analysis of axonal vesicles carrying QD-NGF confirmed this finding. The majority of QD-NGF was found to localize in vesicles 50–150 nm in diameter with a single lumen and no visible intralumenal membranous components. Our findings point to the possibility that a single NGF dimer is sufficient to sustain signaling during retrograde axonal transport to the cell body

Reaching out for signals: filopodia sense EGF and respond by directed retrograde transport of activated receptors

ErbB1 receptors situated on cellular filopodia undergo systematic retrograde transport after binding of the epidermal growth factor (EGF) and activation of the receptor tyrosine kinase. Specific inhibitors of the erbB1 receptor tyrosine kinase as well as cytochalasin D, a disruptor of the actin cytoskeleton, abolish transport but not free diffusion of the receptor–ligand complex. Diffusion constants and transport rates were determined with single molecule sensitivity by tracking receptors labeled with EGF conjugated to fluorescent quantum dots. Retrograde transport precedes receptor endocytosis, which occurs at the base of the filopodia. Initiation of transport requires the interaction and concerted activation of at least two liganded receptors and proceeds at a constant rate mediated by association with actin. These findings suggest a mechanism by which filopodia detect the presence and concentration of effector molecules far from the cell body and mediate cellular responses via directed transport of activated receptors

Combined High-Speed Single Particle Tracking of Membrane Proteins and Super-resolution of Membrane-Associated Structures

Many experiments have shown that the diffusive motion of lipids and membrane proteins are slower on the cell surface than those in artificial lipid bilayers or blebs. One hypothesis that may partially explain this mystery is the effect of the cytoskeleton structures on the protein dynamics. A model proposed by Kusumi [1] is the Fence-Picket Model which describes the cell membrane as a set of compartment regions, each ~ 10 to 200 nm in size, created by direct or indirect interaction of lipids and proteins with actin filaments just below the membrane. To test this hypothesis, we have assembled a high-speed single particle tracking microscope and use a hybrid tracking and super-resolution approach on the same cell. We labeled the high-affinity FceRI receptor in Rat Basophilic Leukemia (RBL) cells and tracked these transmembrane proteins at up to 1000 frames per second. The cells were fixed immediately after tracking and further labeled for super-resolution imaging of actin filaments and other membrane-associated components were collected. For best correlation of tracking and super-resolution, we refined a fixation protocol to prevent morphology changes during the fixation process that often go unnoticed. Bright field images allow re-alignment of cell with about ~ 10 nm precision. This sequential approach allows use of far-red dyes for tracking and super-resolution, ameliorating chromatic aberrations. We will present the results of this high-speed tracking within the context of actin and other membrane associated proteins imaged with ~ 20 nm resolution. [1].Ritchie, K.; Iino, R.; Fujiwara, T.; Murase, K.; Kusumi, A. The fence and picket structure of the plasma membrane of live cells as revealed by single molecule techniques (Review). Mol. Membr. Biol. 2003, 20, 13−18

Imaging molecular interactions in cells by dynamic and static fluorescence anisotropy (rFLIM and emFRET)

We report the implementation and exploitation of fluorescence polarization measurements, in the form of anisotropy-lifetime (rFLIM) and resonance energy migration (emFRET) modalities, for wide-field, confocal laser scanning, and flow cytometric microscopy of cells. These methods permit the assessment of rotational motion, association, and proximity of cellular proteins in vivo. They are particularly applicable to probes generated by fusions of Visible Fluorescence Proteins (VFPs), as exemplified by studies of the erbB receptor tyrosine kinases involved in growth-factor mediated signal transduction

Beteiligte Signalwege an der Entstehung der Urkeimzellen in Platynereis dumerilii (Annelida, Polychaeta)

Urkeimzellen haben innerhalb eines Organismus eine wichtige Aufgabe; ohne sie kann keine neue Generation entstehen. Ihre Entwicklung muss einer genauen Regulation unterliegen, da schon kleinste Fehler den Verlust der Fortpflanzungsfähigkeit bedeuten können. Über die an der Entwicklung der Urkeimzellen beteiligten Signalwege in Wirbellosen ist bisher nur wenig bekannt. Deshalb wurde hierzu Untersuchungen an dem marinen Polychaetne Platynereis dumerilii durchgefürht Da in Vertebraten die Entwicklung der Urkeimzellen durch das Steroidhormon Estradiol beeinflusst werden konnte (Ge et al., 2012; La Sala et al., 2010), wurde untersucht, ob in Platynereis ein ähnlicher Effekt vorliegt. Tatsächlich konnten nach Behandlungen von 2 bis 24 h mit Estradiol Larven mit mehr als vier Urkeimzellen gefunden werden (Lidke et al, in press). Ebenso wie Estradiol erhöhte auchdas Xenoestrogens Ethinylestradiol die Anzahl der Urkeimzellen Eine Behandlung mit Estradiol nach 24 h ergab keine Larven mit erhöhter Anzahl von Urkeimzellen. Das Zeitfenster für die Empfindlichkeit der Embryonen für Estradiol ließ sich auf 4 h bis 9 h eingrenzen, d.h.die Urkeimzellen ließen sich nur zum Zeitpunktihrer Entstehung durch Estradiol beeinflussen. Der Estradiolrezeptor Inhibitor ICI182 780 konnte den durch Estradiol erzeugten Effekt blockieren. Dies zeigt, dass der Estradiolrezeptor an der Erhöhung der Urkeimzellen-Anzahl beteiligt ist. Um zu zeigen, zu welchem Zeitpunkt der Estradiolrezeptor in Platynereis nachzuweisen ist, wurden Westernblots mit verschiedenen Antikörpern durchgeführt, die jedoch alle keine eindeutige Bande entsprechender Größe detektieren konnten. Im Gegensatz dazu war der Nachweis der Estradiolrezeptor mRNA in 6 h alten Embryonen durch In Situ Hybridisierung erfolgreich. Anhand des Proliferationsmarkers EdU konnte gezeigt werden, dass nach einer Behandlung mit Estradiol auch noch nach 8 h Urkeimzellen entstehen, anstatt wie normalerweise zwischen 6 h und 8 h. Der Versuch, mögliche Zielgene des Estradiol-Signalweges mit Hilfe von RT PCR aufzuzeigen, war aufgrund der geringen Anzahl der Urkeimzellen im Embryo jedoch nicht möglich. Wurde zunächst noch davon ausgegangen, dass die überzähligen Urkeimzellen durch einen genomischen Signalweg des Estradiolrezeptors zustande kamen, so zeigte der Einsatz eines Proteinkinase B (AKT) Inhibitors, dass es sich höchstwahrscheinlich um sogenanntes ‚Rapid Signaling‘ handelte (Moriarty et al., 2006). AKT Inhibitor alleine erzeugt Larven mit weniger als vier Urkeimzellen. Der AKT Signalweg scheint also an der Entstehung der Urkeimzellen beteiligt zu sein. Als mögliches Ziel von AKT kam die Glykogen Synthase Kinase 3β (GSK3β) in Frage. Ihre Beteiligung an der Entwicklung der Urkeimzellen wurde mit Hilfe des GSK3β Inhibitors Azakenpaullon (Azp) untersucht. Eine Behandlung während der Entstehung des Mesoblasten 4d (4 h bis 5 h) sorgte für eine verringerte Anzahl der Urkeimzellen, während eine spätere Behandlung von 5,5 h bis 6,5 h zu einem Anstieg der Urkeimzellen Anzahl führte. Die GSK3β scheint neben AKT eine wichtige Rolle bei der Urkeimzellen-Entwicklung zu spielen. Da β-Catenin ein durch GSK3β reguliertes Protein ist, wurden mit verschiedenen Antikörpern versucht, in Embryonen eine Veränderung der GSK3β Aktivität nachzuweisen. In einzelnen Fällen gelang eine immunohistochemische Färbung des β-Catenin, jedoch aufgrund der nicht zuverlässigen Wirkung der Antikörper konnte eine Veränderung der β-Catenin Lokalisation nicht systematisch untersucht werden. Da der FGF Rezeptor unter anderem AKT aktivieren kann (Kalff und Spencer, 2012), sollte durch den Einsatz des FGFR Inhibitors SU5402 untersucht werden, ob der Rezeptor an der Entstehung der Urkeimzellen beteiligt ist. Der Inhibitor erzeugte Larven mit einer verringerten Anzahl der Urkeimzellen. Eine Verknüpfung von FGFR und AKT könnte in diesem Fall vorliegen. Weiter wurde eine Nanos Response Elements in der untranslatierten 3‘ Region der Sequenz des FGFR gefunden. Dies könnte bedeuten, dass der FGFR durch den Keimzellmarker Nanos in den Urkeimzellen normalerweise herunterreguliert wird. Sowohl für den MAP Kinase Signalweg, als auch für den Notch-Delta Signalweg konnten bereits Verbindungen zu FGFR oder GSK3β bei anderen Spezies aufgezeigt werden (Espinosa et al., 2003; Kalff und Spencer, 2012; Kim und Snider, 2011). Die Beeinflussung beider Signalwege mit spezifischen Inhibitoren zeigte jedoch keine Änderungen in der Anzahl der Urkeimzellen bei Platynereis. In beiden Fällen wurde bisher jedoch nur eine Konzentration ausgetestet, wodurch sich eine Beteiligung der beiden Signalwege bisher nicht endgültig ausschließen lässt. Neben der Untersuchung der an der Urkeimzell-Entwicklung beteiligten Signalwege wurden noch weitere Ergebnisse erzielt. Die komplette Sequenz des PduVasa Inserts im Plasmid ‚Vasa Clon A‘ wurde ermittelt. Ebenfalls konnten Fragmente von Pdu-Aktin und Pdu-CyclinB1 kloniert und sequenziert werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass sich die Färbung von α-Tubulin mit Hilfe eines entsprechenden Antikörpers dazu eignet, um als mögliche Gegenfärbung zu β-Catenin zu fungieren. Da sich der immunhistochemische Nachweis des Vasa Proteins bei Embryonen als schwierig erwies, wurde zudem versucht, die Urkeimzellen in Embryonen durch Kernfärbungen mit DAPI oder Propidium Jodid sichtbar zu machen. Da die Urkeimzellen jedoch nach kurzer Zeit in den Embryo einwandern, waren diese nur sehr schwierig im Embryo zu finden Im Rahmen dieser Arbeit konnte also gezeigt werden, dass Estradiol eine proliferative Wirkung auf die Urkeimzellen von Platynereis hat. Weiterhin konnte ein Modell aufgestellt werden, das eine mögliche Beteiligung und Verknüpfung von FGFR, AKT und GSK3β bei der Entwicklung der Urkeimzellen beinhaltet

Imaging molecular interactions in cells by dynamic and static fluorescence anisotropy (rFLIM and emFRET)

We report the implementation and exploitation of fluorescence polarization measurements, in the form of anisotropy-lifetime (rFLIM) and resonance energy migration (emFRET) modalities, for wide-field, confocal laser scanning, and flow cytometric microscopy of cells. These methods permit the assessment of rotational motion, association, and proximity of cellular proteins in vivo. They are particularly applicable to probes generated by fusions of Visible Fluorescence Proteins (VFPs), as exemplified by studies of the erbB receptor tyrosine kinases involved in growth-factor mediated signal transduction

Hidden in the crowd: primordial germ cells and somatic stem cells in the mesodermal posterior growth zone of the polychaete Platynereis dumerillii are two distinct cell populations

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>In the polychaete <it>Platynereis</it>, the primordial germ cells (PGCs) emerge from the <it>vasa</it>, <it>piwi</it>, and <it>PL10 </it>expressing mesodermal posterior growth zone (MPGZ) at the end of larval development, suggesting a post-embryonic formation from stem cells.</p> <p>Methods</p> <p>In order to verify this hypothesis, embryos and larvae were pulse labeled with the proliferation marker 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) at different stages of development. Subsequently, the PGCs were visualized in 7-day-old young worms using antibodies against the Vasa protein.</p> <p>Results</p> <p>Surprisingly, the primordial germ cells of <it>Platynereis </it>incorporate EdU only shortly before gastrulation (6-8 hours post fertilization (hpf)), which coincides with the emergence of four small blastomeres from the mesoblast lineage. We conclude that these so-called 'secondary mesoblast cells' constitute the definitive PGCs in <it>Platynereis</it>. In contrast, the cells of the MPGZ incorporate EdU only from the pre-trochophore stage onward (14 hpf).</p> <p>Conclusion</p> <p>While PGCs and the cells of the MPGZ in <it>Platynereis </it>are indistinguishable in morphology and both express the germline markers <it>vasa</it>, <it>nanos</it>, and <it>piwi</it>, a distinct cluster of PGCs is detectable anterior of the MPGZ following EdU pulse-labeling. Indeed the PGCs form independently from the stem cells of the MPGZ prior to gastrulation. Our data suggest an early PGC formation in the polychaete by preformation rather than by epigenesis.</p