Optimizing and developing a scalable, chemically defined, animal component-free lentiviral vector production process in a fixed-bed bioreactor

Lentiviral vectors (LVVs) play a critical role in gene delivery for ex vivo gene-modified cell therapies. However, the lack of scalable LVV production methods and the high cost associated with them may limit their use. In this work, we demonstrate the optimization and development of a scalable, chemically defined, animal component-free LVV production process using adherent human embryonic kidney 293T cells in a fixed-bed bioreactor. The initial studies focused on the optimization of the culture process in 2D static cultures. Process changes such as decreasing cell seeding density on day 0 from 2.5 × 104 to 5 × 103 cells/cm2, delaying the transient transfection from 24 to 120 h post-seeding, reducing plasmid DNA to 167 ng/cm2, and adding 5 mM sodium butyrate 6 h post-transfection improved functional LVV titers by 26.9-fold. The optimized animal component-free production process was then transferred to the iCELLis Nano bioreactor, a fixed-bed bioreactor, where titers of 1.2 × 106 TU/cm2 were achieved when it was operated in perfusion. In this work, comparable functional LVV titers were obtained with FreeStyle 293 Expression medium and the conventional Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with 10% fetal bovine serum both at small and large scale

Study of turbulent flow inside a stirred tank used in animal cell culture

convention: 1.1.202.10 .F , Développement d'un modèle hydrodynamique multi-échelle décrivant le mélange dans les bioréacteurs utilisés en culture cellulaire. Validation expérimentale par les techniques de visualisation PIV et LI

CFD Large Eddy Simulation of the hydrodynamics of stirred mini-bioreactors operating with stem cell culture mixing conditions

The expansion of hMSC adhered on microcarriers is a proven technology to allow the production of quantitatively (cell density and growth rate) and qualitatively (preservation of cell stemness) the amounts of cells required for clinical applications. In that context of process optimization, a platform of 6 parallel 250 mL stirred minibioreactors have been designed and fully equipped for hMSC cultivation on microcarriers. The local hydrodynamics in these bioreactors have been characterized using CFD simulations and experimental measurements. GOALS: 1) Evaluation of the flexibility of the platform for extensively studying the coupling between hydrodynamics and hMSC physiological response (growth, stemness) by changing agitation conditions. 2) Evaluation of the scale down ability of platform as prediction tool of the hMSC behavior in larger bioreactor scale.Développement d’outils de conception et d’extrapolation de bioréacteurs à cuve agitée utilisés pour la culture de cellules souches mesenchymateuses sur microporteur

Mise au point d’un dispositif de trajectographie optique pour l’étude lagrangienne des écoulements dans une cuve agitée utilisée dans l’industrie pharmaceutique

convention: 2.4.579.09 .FEtude des interactions entre l'hydrodynamique dans les bioréacteurs et la physiologie microbienne : application à la production de lipase par Yarrowia lipolytic

Development of optical trajectography device for the lagangian study of turbulent flow inside a stirred tank used in pharmaceutical industry

Stirred tanks are devices that are widely used in various process steps of the pharmaceutical industry. The performance of these processes (animal cell culture, crystallization, flocculation …) strongly depend on the physico-chemical and hydrodynamic environment present locally in these tanks. To fully describe this local environment, an Eulerian - Lagrangian approach must be adopted in order to establish history of conditions met by a particle as a cell, a crystal or a floc. This approach implies to determine the trajectory followed by the particle. To this aim, the Chemical Laboratory of Liege University has developed a prototype of optical trajectography device. The objective of this paper is to present the device, developments that were necessary for its use and the results obtained. The device is composed of two cameras modeled by a pinhole model which record the position of a bead that has a size equal to 490 µm and that perfectly follows local flow structures. The measured trajectory has been validated by comparing average time velocity fields deduced from it to those measured, in the same operating conditions, by particle image velocimetry (P.I.V.).FRFC 2.4.579.09.

Etude de l'hydrodynamique au sein d'un bioréacteur à cuve agitée utilisé pour la culture de cellules animales adhérentes sur microporteurs: Caractérisation expérimentale et théorique des écoulements via des outils eulériens et lagrangiens

Cette thèse a été financée par le FNRS (Fonds National de Recherche Scientifique belge) via un mandat d’aspirant (1.1.2002.10.F, 78014). Elle a été réalisée au Laboratoire de Génie Chimique de l’Université de Liège sous la supervision des Professeurs Dominique Toye et Michel Crine. La thématique de recherche s’inscrit dans le cadre d’une collaboration scientifique entretenue depuis de nombreuses années entre le Laboratoire de Génie Chimique et la société pharmaceutique GlaxoSmithKline Biologicals. Elle concerne la culture de cellules animales adhérentes sur microporteurs en bioréacteur de type cuve agitée. Ce type de procédé est, en effet, largement utilisé dans l’industrie pharmaceutique pour produire des composés protéinés tels que des vaccins, des glycoprotéines et des anticorps monoclonaux. Le choix du design et des conditions d’agitation de ce type de bioréacteur est complexe car il doit répondre à deux objectifs antagonistes : maximiser le mélange du milieu de culture tout en minimisant les contraintes mécaniques qui peuvent agir sur les cellules animales, ces dernières étant réputées comme particulièrement sensibles à ces contraintes lorsqu’elles sont fixées à la surface de microporteurs. Pour aider à réaliser ce choix, nous avons développé dans cette thèse une méthodologie qui tente de décrire l’influence des conditions d’agitation sur l’environnement hydrodynamique local perçu par un élément de fluide en mouvement via une description combinée eulérienne et lagrangienne de l’écoulement turbulent au sein du bioréacteur. Le Chapitre I a pour but de présenter l’état de l’art relatif à la culture de cellules animales adhérentes dans des bioréacteurs à cuve agitée, ainsi que d’introduire l’essentiel des notions théoriques qui seront utilisées dans la suite de la thèse. Il est divisé en quatre parties. La première partie présente les spécificités de la culture de cellules animales de mammifères et les défis technologiques associés. La deuxième partie introduit, en se basant sur diverses études antérieures, le problème central de cette thèse. La troisième partie présente l’approche adoptée dans cette thèse pour répondre au problème posé. L’originalité de l’approche adoptée est également mise en évidence. Dans la quatrième partie, les hypothèses nécessaires à ce travail sont présentées et validées sur base de résultats issus d’autres études publiées dans la littérature. Le Chapitre II a pour but de sélectionner deux mobiles axiaux auxquels sera appliquée la méthodologie développée dans cette thèse. Pour ce faire, sept mobiles axiaux sont comparés sur base des contraintes mécaniques qu’ils génèrent, estimées à partir de la mesure de la puissance globale dissipée, lorsqu’ils tournent respectivement à leur vitesse minimale de maintien des microporteurs en suspension complète Njs. Cette comparaison permet de sélectionner les mobiles TTP 125 (d/T=0.4, Mixel) et EE 150 (d/T=0.5, Applikon). Le Chapitre III est consacré à l’étude eulérienne détaillée de l’écoulement turbulent généré par les deux mobiles sélectionnés au chapitre précédent. Sur base de mesures 3D P.I.V., les champs moyens de vitesse dans cinq plans axiaux sont établis et analysés. Ce même exercice est réalisé pour les grandeurs caractéristiques de la composante turbulente de l’écoulement que sont l’énergie cinétique turbulente et son taux de dissipation. Grâce à ces données, la répartition spatiale des contraintes mécaniques au sein de l’écoulement turbulent est établie ; ce qui permet d’identifier au sein de la cuve des zones labélisées comme potentiellement problématiques pour le développement des cellules cultivées sur les microporteurs. Dans le Chapitre IV, l’impact de gradients de concentration présents au sein de la cuve, suite à une injection de soude par exemple, est évalué. Dans ce but, le mélange au sein du bioréacteur a été étudié de manière globale par la mesure de temps de mélange et de manière locale par la mesure de l’évolution avec le temps de champs de concentration par la technique P.L.I.F. Ces mesures ont montré que le temps d’ « existence » des gradients de concentration est nettement inférieur aux temps caractéristiques relatifs à une modification du métabolisme cellulaire. Il en résulte que, dans la suite du travail, les champs de concentration seront supposés comme constants et uniformes au sein de la cuve agitée. Les hétérogénéités ponctuellement présentes après l’ajout de soude ne seront donc pas prises en compte dans la caractérisation Euler-Lagrange de l’écoulement. La première partie du Chapitre V présente le principe et les outils de modélisation nécessaires à la mise au point et au fonctionnement du dispositif de trajectographie optique conçu et développé dans le cadre de cette thèse. Cette installation, tout à fait originale et unique, permet de suivre la trajectoire d’une particule au sein de la cuve agitée pendant des temps très longs et permet donc d’accéder à l’étude lagrangienne de l’écoulement. La seconde partie du chapitre est consacrée à la caractérisation des trajectoires mesurées. L’isoprobabilité de présence de la particule dans tout volume élémentaire de la cuve agitée a pu être confirmée. La validité et la convergence des résultats obtenus par trajectographie ont pu être vérifiées par comparaison des champs de vitesse calculés à partir des trajectoires avec ceux mesurés par 3D P.I.V. Au Chapitre VI, les données eulériennes sont combinées aux données lagrangiennes afin de caractériser le lien entre la succession d’environnements hydrodynamiques perçus par des cellules fixées sur des microporteurs et les conditions d’agitation du bioréacteur. Cette caractérisation repose principalement sur l’analyse de la distribution de temps de séjour de la particule dans la zone labélisée comme problématique pour le développement cellulaire DTSzone , de la distribution de temps de séjour de la particule dans la zone non problématique DTShors zone ainsi que sur l’analyse des distributions de temps mis par la particule pour réaliser un cycle « visite de zone problématique-visite de zone non problématique » DTcycle. La taille des zones problématiques et non problématiques dépend de la valeur choisie pour le critère λK/dp, du type de mobile, ainsi que de sa vitesse de rotation. L’impact de ces trois grandeurs sur les distributions de temps a donc été analysé. Cette thèse se clôture bien naturellement par un chapitre de conclusion résumant les informations acquises et proposant diverses perspectivesMandat d'Aspirant 1.1.202.10 .

Outils d’étude pour caractériser l’impact de l’ hydrodynamique sur la culture de cellules animales adhérentes cultivées sur microporteurs en bioréacteurs à cuve agitée

Cette présentation montre l'importance du choix des conditions d'agitation lors de la culture de cellules animales adhérentes sur microporteurs en bioréacteurs à cuve agitée. Elle montre des exemples d'outils pour caractériser à l'échelle locale l'hydrodynamique au sein de ces bioréacteurs et une approche Euler-Lagrange qui a terme permettra de faire le lien entre l'hydrodynamique et la réponse cellulaire grâce à l'établissement de l'historique de conditions rencontrées localement par les cellules