X-ray structure analysis of the elongation factor NusA and the ribosomal protein L4 from Thermotoga maritima

NusA und L4 sind RNA bindende Proteine, die eine zentrale Rolle beim vorzeitigen Abbruch der Transkription des S10 ribosomalen Protein Operons bei einigen Enterobakterien spielen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die dreidimensionalen Strukturen von NusA und L4 aus dem thermophilen Bakterium Thermotoga maritima mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse bestimmt. NusA ist ein annähernd lineares Molekül, das aus vier Domänen besteht. Die N-terminale Domäne, die eine a /b -Faltung zeigt, ist sehr flexibel und wichtig für die Interaktion von NusA mit der RNA-Polymerase. Deshalb erscheint eine Konformationsänderung dieser Region bei Bindung an RNA-Polymerase wahrscheinlich. Der Rest des Proteins ist aus drei RNA bindenden Motiven aufgebaut, einem fünfsträngigen b -barrel (S1 Domäne) und zwei nachfolgenden K-Homologie (KH) Domänen. Diese bestehen aus einem dreisträngigen b -Faltblatt, das auf einer Seite von drei oder vier a -Helices flankiert wird. Zum ersten Mal ist die Anordnung von mehreren KH Motiven in einem Protein zu sehen, die ein Modell für den modularen Aufbau einer Vielzahl von RNA- und DNA-assoziierten Multi-KH Proteinen darstellt. Modelle legen die Vermutung nahe, daß die Kontaktfläche eine kooperative Bindung beider KH Module an RNA erlaubt. Die Interaktionen zwischen der S1 Domäne und dem ersten KH Motiv ähneln der Kontaktfläche zwischen den beiden KH Domänen, wobei ein Stapel aus alternierenden b -Faltblättern und a -Helices erzeugt wird. Eine Region stark positiven Oberflächenpotentials, die fast eine gesamte Flanke des Moleküls umfaßt, vermittelt wahrscheinlich unspezifische Wechselwirkung mit RNA, während die spezifische Erkennung von Sequenzen der Boten-RNA von den einzelnen RNA-bindenden Motiven übernommen wird. Die Struktur legt die Vermutung nahe, daß NusA durch multiple Kontakte mit der transkribierenden RNA-Polymerase verbunden ist, die Boten-RNA kontinuierlich nach regulatorischen Signalen abtastet und bei deren Erkennung eine Modifikation des Elongationskomplexes herbeiführt. In diesem Zusammenhang erscheint es wahrscheinlich, daß NusA eine regulatorische Haarnadelschleife der S10 leader-RNA direkt kontaktiert und es daraufhin zu einer Pausierung der Transkription kommt. Die Struktur von L4 besteht aus einem zentralen sechssträngigen b -Faltblatt, um das herum sieben a -Helices gruppiert sind. Das Protein weist strukturelle Homologie zu einer Reihe von Mononukleotid bindenden Motiven auf. Eine zentrale, 55 Aminosäuren lange Region, die von zwei Helices flankiert wird, ist ungeordnet und nicht im Modell enthalten. Biochemische Experimente und kristallographische Untersuchungen einer anderen Gruppe an der 50S ribosomalen Untereinheit zeigen, daß dieser Teil in erster Linie für den Einbau des Proteins in das Ribosom verantwortlich ist und bei Bindung an ribosomale RNA eine ausgestreckte Konformation annimmt. Zwei fast senkrecht zueinander verlaufende a -Helices im globulären Rumpf von L4 wurden als mögliche Bindungspartner für die Boten-RNA des S10 Operons identifiziert. Durch Mutagenesestudien, die im Rahmen eines Forschungsaufenthaltes in den USA durchgeführt wurden, wurde die regulatorische Region von L4 auf einen weiteren a -helikalen Bereich am C-Terminus ausgedehnt. Unterschiede in der regulatorischen Aktivität zwischen Thermotoga maritima L4 und seinem Escherichia coli Homologen sind wahrscheinlich auf Sequenzunterschiede in dieser Helix zurückzuführen. Da L4 nur minimale Kontakte mit anderen Proteinen innerhalb der großen ribosomalen Untereinheit eingeht, aber über eine ausgedehnte, RNA-bindende regulatorische Region verfügt, erscheint es wahrscheinlich, daß das Protein hauptsächlich über Kontakte zur RNA im Terminationskomplex des S10 Operons verankert wird. Dabei ist es möglich, daß NusA bei Bindung an die S10 leader-Region eine Konformationsänderung in der RNA induziert, die eine Bindungsstelle für L4 schafft.NusA and L4 are RNA binding proteins, which interact during the premature termination of transcription in the S10 ribosomal protein operon of some enterobacteria. NusA is a general transcription factor, which is believed to be a permanent modifier of RNA polymerase during the elongation phase of transcription. L4 is an operon specific transcription factor and part of the large 50S subunit of the ribosome. Within the scope of this thesis, the crystal structures of both proteins from the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima were solved. NusA of Thermotoga maritima is a rod shaped molecule, which consists of four domains. The N-terminal domain is loosely packed and is supposed to mediate the interactions of the protein to RNA polymerase. The rest of NusA shows three putative RNA-binding domains: a five stranded antiparallel beta-barrel, the S1 motif and two K-homology (KH) domains. The latter consist of a three stranded antiparallel beta-sheet packed against three or four alpha-helices on one side. For the first time, the organisation of such domains is seen in a protein, which can serve as a model for numerous modular multi KH RNA-binding proteins. Models for the RNA-binding of NusA suggest a cooperative binding of both KH modules to RNA. The interactions between the S1 domain and the first KH domain resemble the interface between both KH motifs generating an alternating alpha helical - beta sheet stacking. A region with strong positive surface electrostatic potential presumably mediates unspecific interaction to the mRNA. Specific recognition of regulatory signals on the mRNA is done by the RNA-binding domains. The structure of NusA suggests, that the protein continuously scans the mRNA for regulatory signals and induces changes in the transcriptional apparatus. The structure of L4 shows a six stranded mainly parallel beta-sheet as a central core, surrounded by seven alpha helical segments. L4 exhibits structural homology to mononucleotide binding motifs. A central, 55 residues long region, which is flanked by two alpha helices, exhibits no electron density and becomes ordered upon binding to ribosomal RNA. The regulatory region of L4 at the C-terminus is comprised of three non consecutive nearly perpendicular alpha helices. They presumably contact the mRNA

Illegalität von Migranten in Deutschland: Zusammenfassung des Forschungsstandes

Inhaltsverzeichnis: Vorbemerkung; 1. Definition und rechtliche Rahmenbedingungen von Illegalität; 2. Charakterisierung der Forschung in Deutschland; 3. Aufenthaltsrechtliche Illegalität: Motive, Zugangswege und „Ausgänge“; 4. Sozialstrukturelle Merkmale und Lebenssituation von illegalen Migranten; 4.1 Größenordnung der illegalen Bevölkerung; 4.2 Nationale Zusammensetzung; 4.3 Alters- und Geschlechtszusammensetzung; 4.4 Räumliche Verteilung; 4.5 Anschlüsse in der Aufnahmegesellschaft; 4.6 Wohnsituation; 4.7 Kriminalitätsbelastung; 5. Positionen zum Umgang mit illegaler Einwanderung und illegalem Aufenthalt; 6. Der praktische Umgang mit Illegalität in Deutschland: Ausgewählte Problemfelder; 6.1 Gesundheitsversorgung; 6.2 Einschulung von Kindern; 6.3 Illegale Beschäftigung; 7. Aufgaben des Bundesamtes für Migration und Flüchtlinge im Zusammenhang mit Illegalität; 8. Literatu

Helium-Electrospray: an improved sample delivery system for single-particle imaging with X-ray lasers

Imaging the structure and observing the dynamics of isolated proteins using single-particle X-ray diffractive imaging (SPI) is one of the potential applications of X-ray free-electron lasers (XFELs). Currently, SPI experiments on isolated proteins are limited by three factors: low signal strength, limited data and high background from gas scattering. The last two factors are largely due to the shortcomings of the aerosol sample delivery methods in use. Here we present our modified electrospray ionization (ESI) source, which we dubbed Helium-ESI (He-ESI). With it, we increased particle delivery into the interaction region by a factor of 10, for 26 nm-sized biological particles, and decreased the gas load in the interaction chamber corresponding to an 80% reduction in gas scattering when compared to the original ESI. These improvements will lead to a significant increase in the quality and quantity of SPI diffraction patterns in future experiments using He-ESI, resulting in higher-resolution structures

Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing

All metazoan cells carry transmembrane receptors of the integrin family, which couple the contractile force of the actomyosin cytoskeleton to the extracellular environment. In agreement with this principle, rapidly migrating leukocytes use integrin-mediated adhesion when moving over two-dimensional surfaces. As migration on two-dimensional substrates naturally overemphasizes the role of adhesion, the contribution of integrins during three-dimensional movement of leukocytes within tissues has remained controversial. We studied the interplay between adhesive, contractile and protrusive forces during interstitial leukocyte chemotaxis in vivo and in vitro. We ablated all integrin heterodimers from murine leukocytes, and show here that functional integrins do not contribute to migration in three-dimensional environments. Instead, these cells migrate by the sole force of actin-network expansion, which promotes protrusive flowing of the leading edge. Myosin II-dependent contraction is only required on passage through narrow gaps, where a squeezing contraction of the trailing edge propels the rigid nucleus

Migratory Dermal Dendritic Cells Act as Rapid Sensors of Protozoan Parasites

Dendritic cells (DC), including those of the skin, act as sentinels for intruding microorganisms. In the epidermis, DC (termed Langerhans cells, LC) are sessile and screen their microenvironment through occasional movements of their dendrites. The spatio-temporal orchestration of antigen encounter by dermal DC (DDC) is not known. Since these cells are thought to be instrumental in the initiation of immune responses during infection, we investigated their behavior directly within their natural microenvironment using intravital two-photon microscopy. Surprisingly, we found that, under homeostatic conditions, DDC were highly motile, continuously crawling through the interstitial space in a Gαi protein-coupled receptor–dependent manner. However, within minutes after intradermal delivery of the protozoan parasite Leishmania major, DDC became immobile and incorporated multiple parasites into cytosolic vacuoles. Parasite uptake occurred through the extension of long, highly dynamic pseudopods capable of tracking and engulfing parasites. This was then followed by rapid dendrite retraction towards the cell body. DDC were proficient at discriminating between parasites and inert particles, and parasite uptake was independent of the presence of neutrophils. Together, our study has visualized the dynamics and microenvironmental context of parasite encounter by an innate immune cell subset during the initiation of the immune response. Our results uncover a unique migratory tissue surveillance program of DDC that ensures the rapid detection of pathogens

Das Körperkonzept von Prostatakarzinompatienten - Entwicklung und Testung eines Fragebogens zur Erfassung von Einstellungen uro-onkologischer Patienten zum eigenen Körper unter den Einflüssen operationsinduzierter Folgen

Das Ziel der Studie liegt in einer Entwicklung und Testung eines speziell entwickelten Körperkonzeptfragebogens für Patienten nach uro-onkologischen Erkrankungen. Primär soll der Fragebogen durch psychometrische Kriterien auf Tauglichkeit getestet werden, gleichzeitig sollen aber auch epidemiologisch vergleichbare Daten von Patienten nach radikaler retropubischer Prostatektomie (RRP) generiert werden. Für die Testung des Fragebogens wurden insgesamt 329 Teilnehmer (PCa n=229; Gesunde n=100) in 2 Einzelstudien befragt. Anhand dessen konnten psychometrische und faktorenanalytische Kriterien zur Eignung der Items überprüft werden. Die psychometrische Testung der Aussagen führte zur Itemselektion. Es konnte die Eignung von 40 Items nachgewiesen werden, die in den endgültigen Fragebogen übernommen wurden. Die identifizierten Skalen weisen gute psychometrische Kennwerte auf und differenzieren zwischen gesunder und klinischer Stichprobe. Erste Analysen belegen die Validität der Skalen wobei aber die Gültigkeit anhand weiterer Studien geprüft werden muss.The aim of the study is the construction of a questionnaire which determines uro-oncological patients’ attitudes to their own body. The questionnaire will be tested by psychometric criteria for suitability. By doing this, epidemiological data of patients after radical retropubic prostatectomy (RRP) will be generated. A total of 329 participants (PCa n=229; healthy n=100) were questioned in 2 studies. Thereafter the suitability of the items could be checked by psychometric and factor analytic criteria. The psychometric testing of the statements led to a selection of the items. 40 items could be established as applicable and were therefore accepted for the final questionnaire. The indentified scales shows good psychometric characteristics and also differentiate between the healthy and the clinical samples. Preliminary analyses prove the validity of the scales, although this should be subjected to further testing for assurance.vorgelegt von Michael Worb