Efeitos da substituição do soro fetal bovino (SFB) e da albumina sérica bovina (BSA) pela ovalbumina (OVA) na produção in vitro de embriões bovinos.

As biotecnologias aplicadas à reprodução animal vêm causando grandes impactos à produção animal, principalmente nas últimas duas décadas. Historicamente, o meio de cultivo contém SFB ou BSA, que são preparados e purificados a partir de produtos derivados sangUíneos e apresentam altos riscos de contaminação por patógenos, como vírus: BHV-I e BVDV (GUERIN et ai., Buli Academic Veterinarian France, v.61, po513-520, 1988), e prions: BSE (KRISHER et ai., Biology of Reproduction, v.60, p.1345-1352, 1999). De acordo com Barlian et ai. (Cell Biology Intemational, v.17, p.677-684, 1993), a OVA é um suplemento protéico não aparentado ao BSA, mas que -possui a capacidade de manter a proliferação celular. Além disso, por ser de origem heteróloga, os riscos de transmissão de doenças são menores. O presente trabalho objetivou avaliar os efeitos da substituição do SFB e do BSA pela OVA na PIV. Os oócitos foram maturados in vitro (MlV) em meio TCM 199 com sais de Earle, suplementado de acordo com os tratamentos: SFB (10% SFB; Crypion«», BSA (Inlab«>; 4mgimL BSA), OVA (Inlab«>; 4mg/mLOVA), e 1,0~gimL de FSH (Pluset>C, alier), 50ug/mL de hCG (Profasi«>,S erono), 1,0ug/mL de estradiol (Sigma E-2758), 0,2mM de piruvato de sódio e 83,4ugimL de amicacina, durante 24h à 38,5°C e atmosfera de 5% de CO2 em aro A fecundação in vitro (FIV) foi realizada após 24h de MIV, em meio TALP-FIV, com 0,2mM de piruvato, 83,4ugimL de amicacina e suplementado de acordo com os tratamentos: 6mgimL de BSA ou 6mgimL de OVAo Após o ténnino da incubação com os espennatozóides, os prováveis zigotos foram submetidos ao cultivo em meio SOF e suplementado de acordo com os tratamentos (SFB, BSA ou OVA), atmosfera com baixa tensão de O2 (5% de O" 5% de CO2 e 90% de NJ, umidade saturada, em câmara modular e mantida em incubadora de cultivo à 38,5C1Cd, urante 7 a 8 dias, para atingirem o estádio de blastocisto. Os tratamentos foram nomeados da seguinte maneira: a primeira letra referente à etapa de maturação, a segunda à fecundação, e a terceira ao cultivo. Para avaliação quantitativa, foram utilizados 2355 oócitos bovinos distribuídos entre sete grupos experimentais: CONT, SBS, SOS, BBB, BOB, 000 ou OBO, em cinco repetições. No total dos oócitos avaliados, 1795 (76,22%) clivaram, 646 (27,43% do total de oócitos) tomaram-se blastQcistos e 243 (10,32% do total de oócitos, ou 37,62% do total de blastocistos) eclodiram. A etapa de CIV pennitiu avaliar que os diferentes tratamentos foram semelhantes (p>0,05) quanto à taxa de clivagem. Entretanto, quanto à taxa de produção de blastocistos, o grupo 000 (26,0%) foi semelhante (p>0,05) aos grupos SOS (33,8%), BBB (35,8%), BOB (32%) e OBO (33%), mas foi inferior (p<0,05) aos grupos CONT (45%) e SBS (42,8%). Quanto à taxa de eclosão, o grupo 000 (20,4%), foi inferior (p<0,05) aos grupos CONT (46,2%), SBS (43,4%), SOS (38,4%), BBB (41,6%), e semelhante aos grupos BOB (28,2%) e OBO (25,4%). Apesar da redução na quantidade blastocistos produzidos, concluímos que é possível produzir in vitro embriões bovinos na ausência de SFB e/ou BSA

Efeito do protocolo de sincronização celular na produção de clones bovinos.

Os métodos de sincronização da célula doadora de núcleo para uso em clonagem baseiam-se no bloqueio reverslvel do ciclo celular em pontos especlficos. Idealmente, espera-se que esse bloqueio não provoque prejulzo à viabilidade do embrião reconstituldo após a transferência de núcleo. Este trabalho teve por objetivo avaliar a eficiência do processo de clonagem (taxa de eletrofusão, produção de blastocistos e estabelecimento de prenhez) a partir de dois protocolos de sincronização celular: privação de soro fetal bovino (SFB) ou cultivo celular até confluência. Oócitos bovinos foram recuperados por aspiração folicular postmortem e maturados in vitro (MIV) por 18h em TCM-199 suplementado com 10% de SFB, 1 ug/mL FSH, 50ug/ mL hCG, 1 ug/mL estradiol, 0,2mM piruvato de sódio e 83,4~g/mL amicacina em atmosfera úmida de 5% de CO2 em ar a 38,5°C. Oócitos apresentando extrusão do primeiro corpúsculo polar foram selecionados, corados com 10ug/mL de Hoechst 33342 e enucleados em fluido sintético de oviduto (SOF) tamponado com HEPES, suplementado com 10% de SFB e 7,5ug/mL de citocalasina B. A reconstituição oocitâria foi realizada com dois grupos de fibroblastos bovinos: Grupo A - cultivados sob privação de SFB por 3 a 5 dias (Dulbecco's Modified Eagle Medium -DMEM suplementado com 0,5% de SFB); ou Grupo B -cultivados até confluência (DMEM suplementado com 10% de SFB). Conjuntos citoplasto+fibroblasto foram eletrofundidos em solução de manitol 0,28M, com dois pulsos de corrente direta de 2,OKv/cm e duração de 20s cada. A ativação foi realizada por exposição à ionomicina (5 minutos, 5~M) seguida de incubação em SOF suplementado com 20mM cloreto de estrôncio e .\ O~g/mL de citocalasina B por 6 horas. Os provâveis zigotos foram co-cultivados com células da granulosa em SOF suplementado com 2,5% de SFB e 0,5% de BSA em atmosfera úmida de 5% de CO2 em ar a 38,5°C por 7 dias. Alguns blastocistos de cada grupo foram transferidos para fêmeas receptoras previamente sincronizadas. As taxas de eletrofusão e produção de blastocistos dos dois grupos foram submetidas à ANOVA, com nlvel de significância de 5%. Houve diferença signiticativaentre os grupos A e B quanto às taxas de eletrofusão: 3,66o/a:!:137,% (549 fundido sem 1631 reconstituidos) contra 40,07% % 11,95% (696 fundidos em 1737 reconstituidos), respectivamente; e quanto ao desenvolvimento até blastocisto: 20,58% % 13,84% (113 blastocistos em 549) contra 34,77o/a:!:1 0,47% (242 blastocistos em 696), respectivamente. Tais diferenças proporcionaram produção média de 5,65 e 12,74 blastocistos por sessão de micromanipulação nos grupos A e B, respectivamente. No grupo A não foram diagnosticadas prenhezes aos 30 dias em 25 receptoras inovuladas; no grupo B foram diagnosticadas 4 gestações a partir de II inovulações (36,4%). Embora a privação de SFB permita o desenvolvimento a termo de clones bovinos (Campbell et al., Nature, 380:64, 1996), existem relatos de maior fragmentação de DNA após utilização da privação (Gibbons et aI., Biol Reprod, 66:895, 2002). Ainda, as menores taxas de eletrofusão, produção de blastocistos e estabelecimento de prenhez observadas no grupo A em comparação ao B, indicam que o uso de fibrob'astos submetidos à privação de SFB não é justiticâvel para o procedimento de clonagem em bovinos

Expressão de DNA metiltransferases em blastocistos bovinos produzidos in vivo e in vitro.

Nos mamiferos, a metilação do DNA é essencial na regulação da expressão gênica e na diferenciação celular. Uma proporção elevada de embriões produzidos por transferência nuclear (TN) é incapaz de estabelecer e sustentar a gestação a termo. Há grande consenso que alterações epigenéticas, primariamente causadas por alterações nos padrões de metilação do DNA, resultam em expressão gênica anormal em embriões e fetos clonados, tomando os indices de sucesso da clonagem frustrantes. Este trabalho objetivou analisar os padrões de expressão das DNA metiltransferases (DNMT) I, 3A e 3B em blastocistos bovinos produzidos in vivo (grupo IV) ou in vilro por FIV (grupo FlV) e transferência nuclear a partir de fibroblastos submetidos à privação de soro fetal bovino (SFB) durante o cultivo (grupo TN-S), ou cultivados até a confluência (grupo TN-C). Uma vez que a linhagem celular doadora de núcleo era proveniente de uma fêmea, os blastocistos dos grupos IV e FIV foram sexados por PCR e somente aqueles do sexo feminino foram utilizados nas etapas posteriores. Após remoção da zona pelucida em PBS pH 2,5, os blastocistos foram individualmente submetidos a um ciclo de amplificação linear do RNA mensageiro utilizando o "Superscript RNA amplification system" (L-l 016, Invitrogen). A transcrição reversa de volume correspondente a I/IOdo RNA de um embrião foi realizada com 6,75JlM de hexâmeros randômicos e transcriptase reversa (Improm-lI Reverse Transcriptase, Promega) seguindo instruções do fabricante. Os ensaios de quantificação relativa dos transcritos dos genes DNMTI, DNMT3A e DNMT3B foram realizados por PCR em tempo real com sistema de detecção TaqMan* (Applied Biosystems); utilizando o gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH) como controle endógeno. Foram utilizados oito embriões por grupo, amplificados em quadruplicata. A eficiência média das amplificações por PCR foi estimada para cada gene utilizando-se uma regressão linear do logaritmo da tluorescência a cada ciclo (Ramakers et aI., Neurosci. Lett., 339:62, 2003); e as razões de expressão calculadas de acordo com metodologia descrita por Livak e Schmittgen (Methods, 25:402, 2001). Para verificar as diferenças significativas foi utilizado o "Pair wise fixed reallocation randomization tes(' (Pfaffi et ai., Nucleic Acids Res., 30:e36. 2002). Todas as razões de expressão foram normalizadas pelo GAPDH e calibradas em função do grupo IV. Não foram detectados transcritos da DNMTI nos blastocistos do grupo TN-S, em contra partida. não se verificaram diferenças estatisticas (P>0,05) entre as razões de expressão dos grupos FIV (0,95) e TN-C (0,77). comparados ao grupo IV. Os grupos de transferência nuclear (TN-C e TN-S) apresentaram razões de expressão numericamente superiores para a DNMT3A (1,89 e 1,99; respectivamente) e para a DNMT3B (1,31 e 2,08; respectivamente) quando comparados aos grupos fertilizados (IV e FIV: 1,00 e 1,50 para DNMT3A; e 1,00 e 1,29 para DNMT3B; respectivamente). no entanto, sem diferenças significativas (P>0,05). A ausência de expressão da DNMTI no grupo TN com fibroblastos submetidos à privação de SFB nos leva a sugerir que embriões clonados a partir deste protocolo sejam menos viáveis do que aqueles oril,lndos de fibroblastos cultivados até confluência. A falta de DNMTl compromete a metilação do DNA a cada ciclo celular e toma os embriões inaptos a manterem as marcações epigcnéticas após cada mitose e sustentar o desenvolvimento fetal

Variabilidade Genética Em Populações De Rottboellia Cochinchinensis Na Cultura Da Cana-de-açúcar

The hypothesis assumed was the existence of biotypes within populations, which has been the cause of difficulties in itchgrass control by farmers. For that, the genetic variability of three populations of Rottboellia cochinchinensis in sugarcane fields in the state of São Paulo was investigated by using the Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) technique. Six primers were used to obtain molecular characterization data. AFLP gels were analyzed based on marker presence (1) and absence (0). Using NTSYs (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System) software, the genetic similarity was calculated by the Jaccard coefficient and, from that, a dendrogram was built through the UPGMA (Unweighted Pair Group Method Arithmetic averages) method, besides determining the isopolymorphic marks. The average genetic similarities seen in the region was 0.742 for Igarapava, 0.793 for Mococa and 0.808 for Piracicaba. Between regions it was 0.730 (Igarapava vs Mococa), 0.735 (Mococa vs Piracicaba) and 0.694 (Igarapava vs Piracicaba). In line with the dendrogram, it is possible to detect the formation of two groups, one with 8 plants from Igarapava and Mococa and the other with 21 plants from Igarapava, Mococa and Piracicaba, as well as the presence of 1 discriminant individual from Piracicaba. It can be concluded that the genetic similarity among itchgrass populations from the state of São Paulo was high (72%), which denotes that the difficulties in chemical management are not only due to different biotypes but also due to other characteristics linked to tolerance of the species to herbicides. However, biotype existence cannot be discarded because of the polymorphic marks generating 22% average genetic variability. © 2016, Sociedade Brasileira da Ciencia das Plantas Daninha. All rights reserved.34347548

Karyotype variability in tropical maize sister inbred lines and hybrids compared with kys standard line.

Maize karyotype variability has been extensively investigated. The identification of maize somatic and pachytene chromosomes has improved with the development of fluorescence in situ hybridization (FISH) using tandemly repeated DNA sequences as probes. We identified the somatic chromosomes of sister inbred lines that were derived from a tropical flint maize population (Jac Duro [JD]), and hybrids between them, using FISH probes for the 180-bp knob repeat, centromeric satellite (CentC), centromeric satellite 4 (Cent4), subtelomeric clone 4-12-1, 5S ribosomal DNA and nucleolus organizing region DNA sequences. The observations were integrated with data based on C-banded mitotic metaphases and conventional analysis of pachytene chromosomes. Heterochromatic knobs visible at pachynema were coincident with C-bands and 180-bp FISH signals on somatic chromosomes, and most of them were large. Variation in the presence of some knobs was observed among lines. Small 180-bp knob signals were invariant on the short arms of chromosomes 1, 6, and 9. The subtelomeric 4-12-1 signal was also invariant and useful for identifying some chromosomes. The centromere location of chromosomes 2 and 4 differed from previous reports on standard maize lines. Somatic chromosomes of a JD line and the commonly used KYS line were compared by FISH in a hybrid of these lines. The pairing behavior of chromosomes 2 and 4 at pachytene stage in this hybrid was investigated using FISH with chromosome-specific probes. The homologues were fully synapsed, including the 5S rDNA and CentC sites on chromosome 2, and Cent4 and subtelomeric 4-12-1 sites on chromosome 4. This suggests that homologous chromosomes could pair through differential degrees of chromatin packaging in homologous arms differing in size. The results contribute to current knowledge of maize global diversity and also raise

Avaliação qualitativa e quantitativa da deposição de calda de pulverização em Commelina diffusa

Objetivou-se neste trabalho avaliar a quantidade e qualidade da deposição da calda de pulverização em plantas de Commelina diffusa, considerando volumes de aplicação, pontas de pulverização e o ângulo dos bicos na barra de pulverização. Foram utilizadas cinco hastes de plantas por vaso. O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado, com 20 repetições. O experimento foi realizado em casa de vegetação, e a aplicação da calda foi efetuada após 40 dias do transplantio das hastes, quando estavam com 30 a 40 cm de comprimento (em pleno desenvolvimento). Foram avaliadas cinco pontas de pulverização: TX-VK 6 (100 L ha-1), TX-VK 8 (200 L ha-1), XR 11001 VS (100 L ha-1), XR 11002 VS (200 L ha¹) e TJ60 11002 VS (100 e 200 L ha-1), as quais foram testadas com diferentes ângulos de aplicação (0º e +30º), exceto a TJ60 11002 VS. Foi utilizado como traçador o corante Azul Brilhante FDC-1 na concentração de 500 ppm, na determinação da deposição da calda de pulverização. Imediatamente após a aplicação, 20 hastes foram coletadas e, em seguida, lavadas em 100 mL de água destilada, para posterior quantificação do traçador em espectrofotômetro. Os dados foram transformados em valores de depósitos por grama de massa seca e ajustados à curva de regressão pelo modelo de Gompertz. Independentemente da ponta utilizada, o volume de 200 L ha-1 proporcionou os maiores depósitos nas plantas, destacando-se a ponta TJ60. A ponta XR 11001 VS (100 L ha-1) proporcionou a melhor uniformidade quando se utilizou o ângulo de +30º.The objective of this study was to evaluate the quantity and quality of spray deposition in Commelina diffusa plants, considering application volume, spray nozzles and the angle of the bar of the spray nozzles. Five stems of plants/pot were planted. The experimental treatments were set up on a randomized design with twenty replications. The experiment was carried out under greenhouse conditions and the solution was applied after 40 days of stem transplanting, when the plants were between 30 to 40 cm long (in full development). Five spray nozzles (TX-VK 6 (100 L ha¹ ), TX-VK 8 (200 L ha-1), XR 11001 VS (100 L ha-1), XR 11002 VS (200 L ha-1) and TJ60 11002 VS (100 and 200 L ha-1), were evaluated, using different angles of application (0º and +30º), except for TJ60 11002 VS nozzle. Brilliant blue FDC 1 was used as a tracer solution, with 500 ppm to determine spray deposition. Immediately after application, twenty weed stems were collected, and washed in 100 mL of distilled water for posterior tracer quantification in a spectrophotometer. The data were adjusted to a regression curve, according to the Gompertz model. Independent of the spray nozzle used, the volume of 200 L ha-1 provided the most deposits on the plants, with the TJ60 nozzle being the most outstanding. The XR 11001 VS nozzle (100 L ha-1) provided the best uniformity when an angle of +30º was used