The impact of copper, nitrate and carbon status on the emission of nitrous oxide by two species of bacteria with biochemically distinct denitrification pathways

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Charakterisierung der N-terminal verlängerten Isoform des humanen TRPV6-Ionenkanals in einem Überexpressionsmodell

Die Superfamilie der Transient Receptor Potential (TRP)-Ionenkanäle ist eine große Gruppe von Kationenkanälen, die in einer Vielzahl fundamentaler physiologischer Prozesse involviert sind. Innerhalb der TRP-Familie weist der TRPV6- (Transient Receptor Potential Vanilloid Subfamily Member 6), neben dem TRPV5-Ionenkanal, die größte Selektivität für Ca2+ auf (PCa/PNa>100). Der TRPV6-Ionenkanal ist in apikalen Membranen von Ca2+-transportierenden Epithelien verschiedener Gewebe unterschiedlich stark exprimiert und spielt in der Aufnahme von Calcium-Ionen eine wichtige Rolle. Eine veränderte TRPV6-Expression ist mit einer Reihe verschiedener Erkrankungen, einschließlich zahlreicher Tumorarten, assoziiert. Die Translation des humanen TRPV6-Proteins wird an einem nicht-kanonischen ACG-Startcodon initiiert, das 120 Nukleotide stromaufwärts, im gleichen Leseraster des ersten kanonischen AUG-Startcodons liegt. Das resultierende humane full-length TRPV6-Protein besteht aus 765 Aminosäuren (NM_018646). Das zunächst annotierte Protein mit 725 Aminosäuren stellt somit eine N-terminale Deletionsvariante dar. Die Sequenz der zusätzlichen 40 Aminosäuren weist keine Ähnlichkeit zu anderen bekannten Proteinsequenzen auf. Die heterologe Expression des full-length TRPV6-Proteins als auch der Deletionsvariante führte in Säugetier-Zelllinien zu funktionellen Ionenkanälen. Mit der vorliegenden Dissertation wurde das Ziel verfolgt, die Ionenkanal-Eigenschaften des humanen full-length TRPV6-Proteins und der TRPV6-Deletionsvariante in lebenden Zellen vergleichend zu analysieren und dadurch Hinweise auf mögliche Funktionen der zusätzlichen 40 N-terminalen Aminosäuren zu erhalten. Dazu wurden TetOn-regulierbare, stabile Zelllinien entwickelt, die das humane full-length TRPV6-Protein bzw. die TRPV6-Deletionsvariante als Fusionsprotein mit einem C-terminalen mCherry-Fluoreszenztag exprimierten. Durch die stabile, regulierbare Expression in CHO-K1-Zellen konnte eine bessere Vergleichbarkeit der Daten erzielt werden. Das TRPV6-mCherry-Fusionsprotein erlaubte die Quantifizierung der hTRPV6-Überexpression parallel zum Calcium-Imaging als auch subzelluläre Lokalisationsstudien. Bei gleicher Doxyzyklin-Induktion war die Deletionsvariante 3-fach höher exprimiert als das full-length TRPV6-Protein. Beide Varianten der TRPV6-Ionenkanäle waren in den Überexpressionsmodellen funktionell aktiv. Die Bestimmung der Aktivität der in den stabilen Zelllinien exprimierten humanen TRPV6-Ionenkanäle bzw. der deletierten Ionenkanalvariante erfolgte durch nicht-ratiometrische Bestimmung der Änderung der intrazellulären Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i). Für die Analysen wurde ein Flusskammermodell etabliert. Die Messungen der [Ca2+]i wurde in den Zellmodellen in Abhängigkeit von der durch Doxyzyklin-induzierten TRPV6-Expressionshöhe und einer Thapsigargin-Behandlung zur Entleerung der intrazellulären Ca2+-Speicher sowie abhängig von der extrazellulären Ca2+-Konzentration ([Ca2+]e), des extrazellulären pH-Wertes (pHe) und von TRPV6-Antagonisten durchgeführt. Die resultierenden, durch TRPV6-vermittelten Änderungen der [Ca2+]i konnten durch Calcium-Imaging sehr gut aufgelöst und verglichen werden. Durch die internen Kontrollen war es möglich, Ca2+-Einströme, die nicht durch TRPV6-Ionenkanäle vermittelt wurden, zu quantifizieren. Aus den vergleichenden Analysen der [Ca2+]i konnte abgeleitet werden, dass die humanen full-length TRPV6-Ionenkanäle nach Erhöhung der [Ca2+]i, [Ca2+]e und pHe schneller und stärker inhibiert werden als die TRPV6-Deletionsvariante. Bei der pharmakologischen Testung der Zellen mit den Antagonisten Ruthenium Red, La3+, 2-APB und SOR-C13 waren die IC50-Werte für den TRPV6-spezifischen Peptid-Inhibitor SOR-C13 auffallend unterschiedlich: in den Zellen mit Expression der TRPV6-Deletionsvariante war der IC50-Wert 71-fach niedriger als in Zellen mit Expression der full-length TRPV6-Ionenkanäle. Zusätzlich wurde der Einfluss der Überexpression der TRPV6-Ionenkanäle auf Ca2+-abhängige zellphysiologische, einschließlich pathophysiologischer Prozesse, wie Vesikeltransport, Proliferation, Migration, Invasion und Aktivierung des NFAT-Signalwegs untersucht. Bei der Analyse des Vesikeltransportes ergaben sich erste Hinweise auf eine unterschiedliche Regulation der beiden TRPV6-Varianten. Die TRPV6-Deletionsvariante war stärker mit Rab7 kolokalisiert, während das full-length TRPV6-Protein eine stärkere Kolokalisation mit Rab11 aufwies. Die Analyse einer TRPV6-vermittelten Aktivierung des NFAT-Signalweges erfolgte auf der Basis eines Luciferase-Assays. Beide TRPV6-Varianten aktivierten den NFAT-Signalweg, allerdings war die NFAT-Aktivierung durch die Deletionsvariante im Vergleich zum full-length TRPV6 2-fach höher. Die Überexpression der beiden TRPV6-Varianten führte weiterhin zu einer 1,4-fach erhöhten Migrationsgeschwindigkeit der Zellen. In Zusammenfassung aller gezeigten Resultate konnten signifikante, funktionelle Unterschiede zwischen der TRPV6 Deletionsvariante und dem full-length TRPV6-Ionenkanal ermittelt werden, die anzeigen, dass die zusätzlichen 40 Aminosäuren der verlängerten N-terminalen Region einen Einfluss auf die Ca2+-abhängige Inaktivierung des Ionenkanals sowie auf die NFAT-Aktivierung haben. Darüber hinaus weisen die IC50-Werte für den SOR-C13 Inhibitor darauf hin, dass der full-length TRPV6-Ionenkanal im Vergleich zur Deletionsvariante möglicherweise eine unterschiedliche Konformation einnimmt, die die Bindung des Peptid-Inhibitors erschwert

NosL is a dedicated copper chaperone for assembly of the Cuz center of nitrous oxide reductase

Nitrous oxide reductase (N2OR) is the terminal enzyme of the denitrification pathway of soil bacteria that reduces the greenhouse gas nitrous oxide (N2O) to dinitrogen. In addition to a binuclear CuA site that functions in electron transfer, the active site of N2OR features a unique tetranuclear copper cluster bridged by inorganic sulfide, termed CuZ. In copper-limited environments, N2OR fails to function, resulting in truncation of denitrification and rising levels of N2O released by cells to the atmosphere, presenting a major environmental challenge. Here we report studies of nosL from Paracoccus denitrificans, which is part of the nos gene cluster, and encodes a putative copper binding protein. A Paracoccus denitrificans ΔnosL mutant strain had no denitrification phenotype under copper-sufficient conditions but failed to reduce N2O under copper-limited conditions. N2OR isolated from ΔnosL cells was found to be deficient in copper and to exhibit attenuated activity. UV-visible absorbance spectroscopy revealed that bands due to the CuA center were unaffected, while those corresponding to the CuZ center were significantly reduced in intensity. In vitro studies of a soluble form of NosL without its predicted membrane anchor showed that it binds one Cu(I) ion per protein with attomolar affinity, but does not bind Cu(II). Together, the data demonstrate that NosL is a copper-binding protein specifically required for assembly of the CuZ center of N2OR, and thus represents the first characterised assembly factor for the CuZ active site of this key environmental enzyme, which is globally responsible for the destruction of a potent greenhouse gas

Trialogische Forschung im Kontext sozialpsychiatrischer Praxis: eine partizipative Forschung nach dem trialogischen Verständnis im Kontext der sozialpsychiatrischen Angebote der AWO Rostock

Die sozialwissenschaftliche Arbeit macht eine sogenannte trialogische Forschung zum Gegenstand ihrer Betrachtung. Es wurde eine trialogische Forschungsgruppe gegründet. Der Forschungsansatz basiert auf dem Verständnis der partizipativen Sozialforschung. Der Verlauf der trialogischen Forschung wurde mit Hilfe der Grounded Theory analysiert. Ergebnis: die Forschungsgruppe war an allen Phasen der Forschung beteiligt, und alle drei beteiligten Perspektiven haben weitestgehend Berücksichtigung gefunden. Es gab wesentliche Einflussfaktoren im Hinblick auf Partizipation und Gleichberechtigung

Revisiting the metal sites of nitrous oxide reductase in a low-dose structure from Marinobacter nauticus

Funding Information: This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (RTG 1976, Project No. 235777276, and PP 1927, Project No. 311061829 to O.E.) and the European Research Council (Grant No. 310656 to O.E.). The authors thank Lin Zhang for the helpful discussions. Funding Information: Open Access funding enabled and organized by Projekt DEAL. This work was funded by European Molecular Biology Organization, ASTF 282.00-2010, Deutsche Forschungsgemeinschaft, PP 1927, Project No. 311061829, RTG 1976, Project No. 235777276, FP7 Publisher Copyright: © The Author(s) 2024.Copper-containing nitrous oxide reductase catalyzes a 2-electron reduction of the green-house gas N2O to yield N2. It contains two metal centers, the binuclear electron transfer site CuA, and the unique, tetranuclear CuZ center that is the site of substrate binding. Different forms of the enzyme were described previously, representing variations in oxidation state and composition of the metal sites. Hypothesizing that many reported discrepancies in the structural data may be due to radiation damage during data collection, we determined the structure of anoxically isolated Marinobacter nauticus N2OR from diffraction data obtained with low-intensity X-rays from an in-house rotating anode generator and an image plate detector. The data set was of exceptional quality and yielded a structure at 1.5 Å resolution in a new crystal form. The CuA site of the enzyme shows two distinct conformations with potential relevance for intramolecular electron transfer, and the CuZ cluster is present in a [4Cu:2S] configuration. In addition, the structure contains three additional types of ions, and an analysis of anomalous scattering contributions confirms them to be Ca2+, K+, and Cl–. The uniformity of the present structure supports the hypothesis that many earlier analyses showed inhomogeneities due to radiation effects. Adding to the earlier description of the same enzyme with a [4Cu:S] CuZ site, a mechanistic model is presented, with a structurally flexible CuZ center that does not require the complete dissociation of a sulfide prior to N2O binding. Graphical Abstract: The [4Cu:2S] CuZ site in M. nauticus N 2O reductase. The electron density map shown is contoured at the 5 σ level, highlighting the presence of two sulfide ligands. 705x677mm (72 x 72 DPI) (Figure presented.)publishersversionpublishe

Expression of nitrous oxide reductase from Pseudomonas stutzeri in transgenic tobacco roots using the root-specific rolD promoter from Agrobacterium rhizogenes

The nitrous oxide (N2O) reduction pathway from a soil bacterium, Pseudomonas stutzeri, was engineered in plants to reduce N2O emissions. As a proof of principle, transgenic plants expressing nitrous oxide reductase (N2OR) from P. stutzeri, encoded by the nosZ gene, and other transgenic plants expressing N2OR along with the more complete operon from P. stutzeri, encoded by nosFLZDY, were generated. Gene constructs were engineered under the control of a root-specific promoter and with a secretion signal peptide. Expression and rhizosecretion of the transgene protein were achieved, and N2OR from transgenic Nicotiana tabacum proved functional using the methyl viologen assay. Transgenic plant line 1.10 showed the highest specific activity of 16.7 µmol N2O reduced min−1 g−1 root protein. Another event, plant line 1.9, also demonstrated high specific activity of N2OR, 13.2 µmol N2O reduced min−1 g−1 root protein. The availability now of these transgenic seed stocks may enable canopy studies in field test plots to monitor whole rhizosphere N flux. By incorporating one bacterial gene into genetically modified organism (GMO) crops (e.g., cotton, corn, and soybean) in this way, it may be possible to reduce the atmospheric concentration of N2O that has continued to increase linearly (about 0.26% year−1) over the past half-century

Discovery and characterisation of an antibody that selectively modulates the inhibitory activity of plasminogen activator inhibitor-1.

Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) is a serine protease inhibitor (serpin) that regulates fibrinolysis, cell adhesion and cell motility via its interactions with plasminogen activators and vitronectin. PAI-1 has been shown to play a role in a number of diverse pathologies including cardiovascular diseases, obesity and cancer and is therefore an attractive therapeutic target. However the multiple patho-physiological roles of PAI-1, and understanding the relative contributions of these in any one disease setting, make the development of therapeutically relevant molecules challenging. Here we describe the identification and characterisation of fully human antibody MEDI-579, which binds with high affinity and specificity to the active form of human PAI-1. MEDI-579 specifically inhibits serine protease interactions with PAI-1 while conserving vitronectin binding. Crystallographic analysis reveals that this specificity is achieved through direct binding of MEDI-579 Fab to the reactive centre loop (RCL) of PAI-1 and at the same exosite used by both tissue and urokinase plasminogen activators (tPA and uPA). We propose that MEDI-579 acts by directly competing with proteases for RCL binding and as such is able to modulate the interaction of PAI-1 with tPA and uPA in a way not previously described for a human PAI-1 inhibitor