Two novel glycyl radical decarboxylase systems from Clostridium scatologenes and Tannerella forsythensis

Die chemisch schwierige Decarboxylierung von 4-Hydroxyphenylacetat zu p-Kresol wird durch das Enzym 4-Hydroxyphenylacetat-Decarboxylase (4-Hpd) katalysiert. Dieses Enzym wurde gereinigt und als Prototyp einer neuen Gruppe innerhalb der Glycylradikalfamilie (GREs) charakterisiert. Frühere Studien haben gezeigt, dass dieses System in C. difficile Eigenschaften aufweist, die es von den gut untersuchten Systemen Pyruvat Format Lyase (Pfl) und anaerobe Ribonucleotid Reduktase (Nrd) unterscheiden. In dieser Arbeit wurden ähnliche Gene aus Clostridium scatologenes (Csd) und Tannerella forsythensis (Tfd) kloniert und in Escherichia coli exprimiert. Die rekombinanten Enzyme wurden gereinigt und vorläufig charakterisiert. Die rekombinanten Decarboxylasen konnten als Hetereokotamere (HpdBC und CsdBC) oder Heterotetramerer (TfdBC) gereinigt werden, waren aus großen (B) und kleinen (C) Untereinheiten in äquimolaren Mengen zusammen gesetzt, und enthielten im Gegensatz zu Pfl und Nrd vier Eisen- und vier Schwefel-Atome pro Heterodimer. Während das Csd System 4-Hydroxyphenylacetat-Decarboxylase Aktivität zeigte und sowohl von CsdA als auch von HpdA aktiviert wurde, war das Tfd System unter allen getesteten Versuchsbedingungen inaktiv, zeigte aber eine teilweise Aktivierung zur Glycyl-Radikal-Form. Wurden die große Untereinheiten der einzelnen Decarboxylasen genetisch mit den kleinen Untereinheiten kombiniert, konnten in einigen Fällen lösliche Proteine gereinigt werden. Auch hier betrug das molare Verhältnis der beiden Untereinheiten 1:1 und es konnten Eisen und Schwefel nachgewiesen werden. Allerdings waren die nativen Komplexe dieser Proteine deutlich kleiner und konnten nicht in die Glycyl-Radikal-Form überführt werden. Die rekombinanten Aktivatoren (CsdA bzw. TfdA) waren Monomere und enthielten 7-8 Eisen- und 6-7 Schwefel-Atome pro Monomer, das auf einen zweiten, zusätzlich zu dem aus Pfl und Nrd bekannten, [4Fe-4S]-Kluster schließen ließ. Der im EPR detektierte, katalytisch entscheidende [4Fe-4S]+ Kluster wurde in CsdA und HpdA nachgewiesen, unterschied sich aber von den Signalen des Pfl- Activator sowie des Nrd- Activator; im Gegensatz zu letzteren beeinflusste die Substratbindung das EPR-Signal nicht signifikant. Der Aktivierungsprozess von CsdBC sowie HpdBC mit den jeweiligen Aktivatoren war transient; einem steilen Anstieg an spezifischer Aktivität in etwa 10 Minuten folgte ein langsamerer Inaktivierungsprozess mit einer Halbwertszeit von etwa 30 Minuten. Das hierbei das Glycylradikal verschwindet, konnte durch sauerstoff-induzierte Spaltung den aktiven Decarboxylase mittels SDS-PAGE sowie in EPR Messungen gezeigt werden. Ob diese Inaktivierung durch ein Elektron aus dem zusätzlichen [4Fe-4S]-Kluster des Aktivators verursacht wird oder durch den [4Fe4S]-Kluster der Decarboxylasen vermittelt wird, bleibt Gegenstand aktueller Untersuchunge

Toward a Hybrid Biosensor System for Analysis of Organic and Volatile Fatty Acids in Fermentation Processes

Monitoring of organic acids (OA) and volatile fatty acids (VFA) is crucial for the control of anaerobic digestion. In case of unstable process conditions, an accumulation of these intermediates occurs. In the present work, two different enzyme-based biosensor arrays are combined and presented for facile electrochemical determination of several process-relevant analytes. Each biosensor utilizes a platinum sensor chip (14 × 14 mm2) with five individual working electrodes. The OA biosensor enables simultaneous measurement of ethanol, formate, d- and l-lactate, based on a bi-enzymatic detection principle. The second VFA biosensor provides an amperometric platform for quantification of acetate and propionate, mediated by oxidation of hydrogen peroxide. The cross-sensitivity of both biosensors toward potential interferents, typically present in fermentation samples, was investigated. The potential for practical application in complex media was successfully demonstrated in spiked sludge samples collected from three different biogas plants. Thereby, the results obtained by both of the biosensors were in good agreement to the applied reference measurements by photometry and gas chromatography, respectively. The proposed hybrid biosensor system was also used for long-term monitoring of a lab-scale biogas reactor (0.01 m3) for a period of 2 months. In combination with typically monitored parameters, such as gas quality, pH and FOS/TAC (volatile organic acids/total anorganic carbonate), the amperometric measurements of OA and VFA concentration could enhance the understanding of ongoing fermentation processes

Structural basis for the binding of IRES RNAs to the head of the ribosomal 40S subunit

Some viruses exploit internal initiation for their propagation in the host cell. This type of initiation is facilitated by structured elements (internal ribosome entry site, IRES) upstream of the initiator AUG and requires only a reduced number of canonical initiation factors. An important example are IRES of the virus family Dicistroviridae that bind to the inter-subunit side of the small ribosomal 40S subunit and lead to the formation of elongation-competent 80S ribosomes without the help of any initiation factor. Here, we present a comprehensive functional and structural analysis of eukaryotic-specific ribosomal protein rpS25 in the context of this type of initiation and propose a structural model explaining the essential involvement of rpS25 for hijacking the ribosome

Nat Struct Mol Biol

As translation proceeds, the nascent polypeptide chain passes through a tunnel in the large ribosomal subunit. Although this ribosomal exit tunnel was once thought only to be a passive conduit for the growing nascent chain, accumulating evidence suggests that it may in fact play a more active role in regulating translation and initial protein folding events. Here we have determined single-particle cryo-electron microscopy reconstructions of eukaryotic 80S ribosomes containing nascent chains with high alpha-helical propensity located within the exit tunnel. The maps enable direct visualization of density for helices as well as allowing the sites of interaction with the tunnel wall components to be elucidated. In particular regions of the tunnel, the nascent chain adopts distinct conformations and establishes specific contacts with tunnel components, both ribosomal RNA and proteins, that have been previously implicated in nascent chain-ribosome interaction

SecM-Stalled Ribosomes Adopt an Altered Geometry at the Peptidyl Transferase Center

A structure of a ribosome stalled during translation of the SecM peptide provides insight into the mechanism by which the large subunit active site is inactivated

Activation and Regulation of the 4-Hydroxyphenylacetate Decarboxylase System from C. difficile

Summary Humans must adopt to live in a microbial world. The number of microbes associated with the human body alone exceeds the total number of body cells by more than one order of magnitude. Besides, the overall genetic information harboured by the microbial consortium in the human gut exceeds by many times the human genomic information. Some of these informations exhibit detrimental effects on the human well-being. The endeavour to understand these reactions more precisely does not only inspire the scientific community, but was also the driving force for this work concerning the activation and regulation of the 4-hydroxyphenylacetate (HPA) decarboxylase system of Clostridium difficile. The HPA decarboxylase system catalyses the final step in tyrosine-fermentation, liberating the toxic end product p-cresol. The postulated mechanism of this reaction includes a number of radical intermediates and is tightly regulated on the protein as well as on the DNA level. Besides the two protein partners (activating enzyme: HpdA, and decarboxylase: HpdBC) the system includes five redox-active iron-sulfur centres, is dependent on S-adenosylmethionine (SAM) as radical generator and requires an external electron-source. During the time-course of this work it could be established that the activating enzyme contains three catalytically essential [4Fe-4S] clusters. The other members of this protein-family (SAM radical family) coordinate just one, previously already well characterised cluster. The catalytic need for the additional clusters could be evaluated by mutational analysis of the cluster binding sites and biochemical analysis. In the presence of SAM and an electron source the activating enzyme initiates the glycyl-radical formation in the main enzyme. Quantifying the 5’ deoxyadenosine liberated by this reaction, allowed the description of a futile cycle, which runs parallel to the catalytic process. It could also be validated that the activation process is dependent on an external electron-source and that storage of an electron is not possible. In contrary, the decarboxylase, which also contains two [4Fe-4S] centres, is able to hold back electrons and uses them to dissipate the glycyl-radical over time. This process – first described as transient activation – makes the HPA decarboxylases unique among most other well described members of the glycyl-radical family, where the radical is stable over prolonged incubation times. In this respect the recently solved crystal structure of CsdBC gave further evidence that the coordination of the [4Fe-4S] clusters is mediated by the small subunit (CsdC) and confirmed the hetero-octameric nature of the complex of the inactive precursor, which is essential for catalysis. Not only for the fast activation of the system but also for the intrinsic inactivation mediated by the small subunit, the redox-properties of the [4Fe-4S] centres are of utmost importance in the regulation of the HPA-decarboxylase systems

Heterologe Produktion und Reifung einer löslichen sauerstofftoleranten [NiFe]-Hydrogenase aus Cupriavidus necator in Escherichia coli

Ziel dieser Arbeit war die Produktion und Reifung einer O2-toleranten [NiFe]-Hydrogenase, der SH aus Cupriavidus necator (Cn), in Escherichia coli (Ec). Zu diesem Zweck wurde zunächst ein verfügbares Basis-Klonierungssystem (StarGate®, IBA) erweitert, um den Anforderungen einer Multigen- und Hochausbeute-Expressionsplattform für den Modellorganismus Escherichia coli zu entsprechen. Die erste Erweiterung beinhaltete das Design neuer Fusionsvektoren, die jedes Gen unter Kontrolle individueller T7-Promotoren und –Terminatoren stellen und die Verknüpfung jedes Genprodukts mit N- oder C-terminalen StrepII-Tags ermöglichen. Unter Einsatz des neuen Systems wurden insgesamt 21 Hydrogenase-assoziierte Cn-Gene, darunter die fünf SH-Stukturgene sowie zwei vollständige Sätze putativer Reifungsgene, systematisch zu funktionalen Multigen-Einheiten (Modulen) assembliert. Die Koexpression von bis zu 10 Genen innerhalb von SH- oder Reifungsmodulen auf einem Plasmid konnte erfolgreich demonstriert werden. Um eine Kombination der SH-Gene mit den Reifungsmodulen in einer Zelle zu ermöglichen, erfolgte anschließend die Entwicklung kompatibler Akzeptorvektoren. Daraufhin konnten Expressionsstämme mit unterschiedlichen Vektor- und Modul-Kombinationen generiert, und damit sowohl SH-Produktions- als auch kombinatorische Studien zum SH-Reifungsprozess ermöglicht werden. SH-Produktionsversuche mit rekombinanten Ec-Stämmen deuteten darauf hin, dass die maximale Löslichkeit und Funktionalität der Reifungsproteine nicht nur von der Gendosis und Expressionsrate, sondern auch maßgeblich von einem transienten, wachstumsabhängigen zellulären Milieu abhängig ist. Aus diesem Grund wurde eine spezielle Kultivierungsstrategie zur SH-Produktion erarbeitet, welche auf einem bekannten Laktose-Autoinduktionssystem basiert. Im Zuge umfangreicher Optimierungsstudien wurden aerobe Langzeit-Kultivierungen mit sequentieller Modifikation der physikalischen Wachstumsparameter und der Medienzusammensetzung vorgenommen. Die Strategie wurde auf die rekombinanten Stämme angewendet und ergab eine einheitliche maximale SH-Aktivität innerhalb der mittstationären Phase 36–40 Stunden nach Inokulation. Maximale spezifische Aktivitäten in Extrakten lagen mit 7,2 U•mg-1 in der Größenordnung der Werte, welche bei optimierten Kultivierungen zur Produktion nativer SH in Cn erreicht wurden. Die Kombination der vorgestellten Expressionsplattform mit dem erarbeiteten Kultivierungsprozess stellt somit die erste Hochausbeute-Produktionsplattform für eine rekombinante [NiFe]-Hydrogenase dar. StrepII-getaggte SH-Varianten konnten homogen aus Zellen rekombinanter Stämme isoliert werden. Mit bis zu 227 U•mg-1 wurde hierbei die höchste bisher für die SH dokumentierte spezifische Aktivität erreicht. In diesen hochreinen Präparationen war die Enzymausbeute verringert, lag jedoch stets im Milligramm-Bereich pro Liter Kultur. Sowohl hinsichtlich der oligomeren Enzymstruktur als auch der katalytischen Eigenschaften entsprachen die rekombinanten Varianten der aus Cn-Zellen isolierten Wildtyp-SH. Durch Entwicklung der kombinatorischen Expressionsplattform wurden innovative Strategien zur Untersuchung des Reifungsprozesses von [NiFe]-Hydrogenasen ermöglicht. Dies wurde anhand der SH als Modellenzym demonstriert. Einzelne Proteine sowie essentielle Reifungs-Intermediate (Komplexe) zweier unabhängiger Reifungsmodule aus Cn wurden rekombinant produziert und gereinigt. Dies lieferte Hinweise darauf, dass die Stabilität der einzelnen Reifungsproteine in vivo stark von der Ausbildung oligomerer Formen und stöchiometrischer Reifungs-Komplexe abhängt. Durch Reinigung der SH-spezifischen Endopeptidase HoxW konnten darüber hinaus Hinweise auf ein redoxaktives [4Fe-4S]-Cluster mit bislang unbekannten Eigenschaften geliefert werden. In-vivo-Deletions- und Substitutionsstudien mit analogen Reifungsproteinen (Hyp) verschiedener Module aus Cn und Ec lieferten darüber hinaus Erkenntnisse über Spezifitäten und damit die Möglichkeit partieller Komplementation. Durch Entwicklung eines zellfreien in-vitro-Reifungssystems für die SH konnten die in-vivo-Experimente anschließend entscheidend ergänzt werden. Essentielle Komponenten und limitierende Faktoren des Reifungsprozesses wurden ermittelt. Erste „Pulldown“-Experimente lieferten Hinweise darauf, dass bislang unbekannte Reifungsintermediate durch das in-vitro-System identifiziert werden könnten. Dadurch erweist sich die vorgestellte Methodik als potentes grundlagenorientiertes Werkzeug zur Untersuchung des Reifungsprozesses