Integrin-Dependent Activation of the JNK Signaling Pathway by Mechanical Stress

Mechanical force is known to modulate the activity of the Jun N-terminal kinase (JNK) signaling cascade. However, the effect of mechanical stresses on JNK signaling activation has previously only been analyzed by in vitro detection methods. It still remains unknown how living cells activate the JNK signaling cascade in response to mechanical stress and what its functions are in stretched cells

Structural and biophysical properties of the integrin-associated cytoskeletal protein talin

Talin is a large cytoskeletal protein (2541 amino acid residues) which plays a key role in integrin-mediated events that are crucial for cell adhesion, migration, proliferation and survival. This review summarises recent work on the structure of talin and on some of the structurally better defined interactions with other proteins. The N-terminal talin head (approx. 50 kDa) consists of an atypical FERM domain linked to a long flexible rod (approx. 220 kDa) made up of a series of amphipathic helical bundle domains. The F3 FERM subdomain in the head binds the cytoplasmic tail of integrins, but this interaction can be inhibited by an interaction of F3 with a helical bundle in the talin rod, the so-called “autoinhibited form” of the molecule. The talin rod contains a second integrin-binding site, at least two actin-binding sites and a large number of binding sites for vinculin, which is important in reinforcing the initial integrin–actin link mediated by talin. The vinculin binding sites are defined by hydrophobic residues buried within helical bundles, and these must unfold to allow vinculin binding. Recent experiments suggest that this unfolding may be mediated by mechanical force exerted on the talin molecule by actomyosin contraction

Structure of a double ubiquitin-like domain in the talin head: a role in integrin activation

Talin is a 270-kDa protein that activates integrins and couples them to cytoskeletal actin. Talin contains an N-terminal FERM domain comprised of F1, F2 and F3 domains, but it is atypical in that F1 contains a large insert and is preceded by an extra domain F0. Although F3 contains the binding site for β-integrin tails, F0 and F1 are also required for activation of β1-integrins. Here, we report the solution structures of F0, F1 and of the F0F1 double domain. Both F0 and F1 have ubiquitin-like folds joined in a novel fixed orientation by an extensive charged interface. The F1 insert forms a loop with helical propensity, and basic residues predicted to reside on one surface of the helix are required for binding to acidic phospholipids and for talin-mediated activation of β1-integrins. This and the fact that basic residues on F2 and F3 are also essential for integrin activation suggest that extensive interactions between the talin FERM domain and acidic membrane phospholipids are required to orientate the FERM domain such that it can activate integrins

Talin connects integrins to the actin cytoskeleton,a structural and functional study

La taline est une protéine multifonctionnelle du cytosquelette qui joue un rôle important dans la connexion du cytosquelette d'actine à une famille de récepteurs membranaires d'adhésion, les intégrines. La taline contient deux sites d'interaction avec les intégrines, un premier au niveau de son domaine globulaire et un deuxième au niveau de son domaine élongé. L'objectif de ce travail de thèse de doctorat était de caractériser le site d'interaction du domaine élongé de la taline avec l'intégrine aIIbb3, au niveau structural et fonctionnel, et de définir la séquence minimale d'interaction. Pour atteindre ce but, trois approches différentes ont été choisies!: i) une approche bioinformatique d'analyse de séquence, ii) une approche cellulaire in vivo, étudiant a)la localisation subcellulaire de fragments recombinants de la taline, fusionnés à DsRed, dans des cellules CHO aIIbb3-GFP et b) l'interaction de ces fragments avec l'intégrine par la technique du FRET (fluorescence resonance energy transfer) et finalement iii) une approche biochimique in vitro d'expériences de coprécipitation et d'interaction protéine-protéine par SPR (surface plasmon resonance) pour confirmer et caractériser l'interaction des fragments de taline avec l'intégrine. La combinaison de ces trois approches nous a permis i) de délimiter précisément un site d'interaction avec la sous-unité b3 de l'intégrine aIIbb3 à une séquence de 42 acides aminés (résidus 2072 à 2113) au niveau du domaine élongé de la taline, ii) de définir par SPR l'affinité pour b3 des fragments de taline contenant le premier (KD=9,7 +- 1,6 x 10-6 s-1) ou le deuxième (KD=6,3 +- 6,2 x 10-4 s-1) site d'interaction avec b3, iii) de montrer que le résidu Tyr747 de la partie cytoplasmique de b3 est important pour l'interaction avec le domaine élongé de la taline, et iv) de souligner l'importance physiologique de cette interaction en montrant par la technique du FRET qu elle a effectivement lieu au sein des cellules.Pas de résum

Le rôle de la taline dans la connexion des intégrines au cytosquelette – une étude structurale et fonctionnelle

La taline est une protéine multifonctionnelle du cytosquelette qui joue un rôle important dans la connexion du cytosquelette d’actine à une famille de récepteurs membranaires d’adhésion, les intégrines. La taline contient deux sites d’interaction avec les intégrines, un premier au niveau de son domaine globulaire et un deuxième au niveau de son domaine élongé. L’objectif de ce travail de thèse de doctorat était de caractériser le site d’interaction du domaine élongé de la taline avec l’intégrine aIIbb3, au niveau structural et fonctionnel, et de définir la séquence minimale d’interaction. Pour atteindre ce but, trois approches différentes ont été choisies!: i) une approche bioinformatique d’analyse de séquence, ii) une approche cellulaire in vivo, étudiant a)la localisation subcellulaire de fragments recombinants de la taline, fusionnés à DsRed, dans des cellules CHO aIIbb3-GFP et b) l’interaction de ces fragments avec l’intégrine par la technique du FRET (fluorescence resonance energy transfer) et finalement iii) une approche biochimique in vitro d’expériences de coprécipitation et d’interaction protéine-protéine par SPR (surface plasmon resonance) pour confirmer et caractériser l’interaction des fragments de taline avec l’intégrine. La combinaison de ces trois approches nous a permis i) de délimiter précisément un site d’interaction avec la sous-unité b3 de l’intégrine aIIbb3 à une séquence de 42 acides aminés (résidus 2072 à 2113) au niveau du domaine élongé de la taline, ii) de définir par SPR l’affinité pour b3 des fragments de taline contenant le premier (KD=9,7 ± 1,6 x 10-6 s-1) ou le deuxième (KD=6,3 ± 6,2 x 10-4 s-1) site d’interaction avec b3, iii) de montrer que le résidu Tyr747 de la partie cytoplasmique de b3 est important pour l’interaction avec le domaine élongé de la taline, et iv) de souligner l’importance physiologique de cette interaction en montrant par la technique du FRET qu’elle a effectivement lieu au sein des cellules

Talin connects integrins to the actin cytoskeleton,a structural and functional study

La taline est une protéine multifonctionnelle du cytosquelette qui joue un rôle important dans la connexion du cytosquelette d'actine à une famille de récepteurs membranaires d'adhésion, les intégrines. La taline contient deux sites d'interaction avec lesPas de résum

Le rôle de la taline dans la connexion des intégrines au cytosquelette (une étude structurale et fonctionnelle)

La taline est une protéine multifonctionnelle du cytosquelette qui joue un rôle important dans la connexion du cytosquelette d actine à une famille de récepteurs membranaires d adhésion, les intégrines. La taline contient deux sites d interaction avec les intégrines, un premier au niveau de son domaine globulaire et un deuxième au niveau de son domaine élongé. L objectif de ce travail de thèse de doctorat était de caractériser le site d interaction du domaine élongé de la taline avec l intégrine aIIbb3, au niveau structural et fonctionnel, et de définir la séquence minimale d interaction. Pour atteindre ce but, trois approches différentes ont été choisies!: i) une approche bioinformatique d analyse de séquence, ii) une approche cellulaire in vivo, étudiant a)la localisation subcellulaire de fragments recombinants de la taline, fusionnés à DsRed, dans des cellules CHO aIIbb3-GFP et b) l interaction de ces fragments avec l intégrine par la technique du FRET (fluorescence resonance energy transfer) et finalement iii) une approche biochimique in vitro d expériences de coprécipitation et d interaction protéine-protéine par SPR (surface plasmon resonance) pour confirmer et caractériser l interaction des fragments de taline avec l intégrine. La combinaison de ces trois approches nous a permis i) de délimiter précisément un site d interaction avec la sous-unité b3 de l intégrine aIIbb3 à une séquence de 42 acides aminés (résidus 2072 à 2113) au niveau du domaine élongé de la taline, ii) de définir par SPR l affinité pour b3 des fragments de taline contenant le premier (KD=9,7 +- 1,6 x 10-6 s-1) ou le deuxième (KD=6,3 +- 6,2 x 10-4 s-1) site d interaction avec b3, iii) de montrer que le résidu Tyr747 de la partie cytoplasmique de b3 est important pour l interaction avec le domaine élongé de la taline, et iv) de souligner l importance physiologique de cette interaction en montrant par la technique du FRET qu elle a effectivement lieu au sein des cellules.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

A fluorescence cell biology approach to map the second integrin-binding site of talin to a 130-amino acid sequence within the rod domain

The cytoskeletal protein talin, which provides a direct link between integrins and actin filaments, has been shown to contain two distinct binding sites for integrin β subunits. Here, we report the precise delimitation and a first functional analysis of the talin rod domain integrin-binding site. Partially overlapping cDNAs covering the entire human talin gene were transiently expressed as DsRed fusion proteins in Chinese hamster ovary cells expressing α IIbβ 3, linked to green fluorescent protein (GFP). Two-color fluorescence analysis of the transfected cells, spread on fibrinogen, revealed distinct subcellular staining patterns including focal adhesion, actin filament, and granular labeling for different talin fragments. The rod domain fragment G (residues 1984-2344), devoid of any known actin- or vinculin-binding sites, colocalized with β 3-GFP in focal adhesions. Direct in vitro interaction of fragment G with native platelet integrin α IIbβ 3 or with the recombinant wild type, but not the Y747A mutant β 3 cytoplasmic tail, linked to glutathione S-transferase, was demonstrated by surface plasmon resonance analysis and pull-down assays, respectively. Here, we demonstrate for the first time the in vivo relevance of this interaction by fluorescence resonance energy transfer between β 3-GFP and DsRed-talin fragment G. Further in vitro pull-down studies allowed us to map out the integrin-binding site within fragment G to a stretch of 130 residues (fragment J, residues 1984-2113) that also localized to focal adhesions. Finally, we show by a cell biology approach that this integrin- binding site within the talin rod domain is important for β 3-cytoskeletal interactions but does not participate in α IIbβ 3 activation