Rôle des chimiokines dans le développement des réactions allergiques (apport des modèles murins)

Les chimiokines sont des cytokines produites constitutivement par les tissus, ou inductibles en situation inflammatoire. Elles permettent le recrutement spécifique de certaines populations leucocytaires vers le lieu de développement de l'inflammation, mais ont également des fonctions immunes plus fines, en contrôlant l'état d'activation et la survie de différentes populations du système immunitaire. Ces protéines ont un rôle essentiel dans l'homéostasie tissulaire, et sont à l'origine de l'orchestration cellulaire des réactions inflammatoires. Les maladies allergiques sont caractérisées par une réponse immune adaptative orientée vers la voie Th2, avec production d'IgE spécifiques, et activation tissulaire de granulocytes par contact avec l'allergène (principalement les mastocytes, puis les polynucléaires éosinophiles). Ces pathologies ont connu au cours des 20 dernières années une recrudescence très forte, avec une prévalence plus importante dans les pays industrialisés. Parmi ces pathologies, l'asthme allergique fait en France plus de 1000 morts par an. Malgré l'amélioration des connaissances des mécanismes physiopathologiques menant à l'altération des tissus ou de la fonction respiratoire, les mécanismes immunologiques à l'origine du développement de ces pathologies restent incomplètement élucidés. Une plus grande compréhension de ces mécanismes, et en particulier du contrôle de l'inflammation par les chimiokines peut permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Pour mettre en évidence ces voies de régulation chimiokiniques, plusieurs modèles animaux ont été utilisés. Le premier consiste en une greffe de peau et de cellules mononucléés humaines chez la souris SCID immunodéficiente. Ce type d'approche permet d'évaluer in vivo le recrutement chimiokinique de cellules humaines vers un tissu humain. Ce modèle a permis de mettre en évidence que l'administration intradermique de CCL17 est à l'origine du recrutement vers les ganglions drainant de lymphocytes TCD4+ mémoires et de cellules dendritiques, et d'un recrutement spécifique vers la peau de cellules polarisée in vitro vers la voie Th2, mais pas Th1. Ces résultats suggèrent l'implication forte de l'axe CCL17/CCR4 dans le développement de pathologies allergiques cutanées, et souligne son potentiel thérapeutique dans des pathologies comme la dermatite atopique. Ce même modèle de xénogreffe cutanée a par ailleurs déjà été utilisé par notre équipe pour évaluer les conséquences de la neutralisation in vivo d'un récepteur chimiokinique, CCR5, à l'aide d'un anticorps. Ce traitement a permis d'abroger le recrutement de lymphocytes T mémoires, et plus particulièrement des lymphocytes polarisés Th1, et de monocytes/macrophages. Ces résultats démontrent l'efficacité in vivo de la neutralisation d'un tel axe chimiokinique. La seconde approche est un modèle murin d'asthme allergique, induit par l'ovalbumine chez la souris Balb/cBYJ. Celui-ci a été utilisé pour l'étude d'une chimiokine humaine originale, CCL18, dont l'implication dans l'asthme allergique chez l'homme à été récemment suggérée par notre équipe. D'un point de vue fonctionnel, l'administration de CCL18 recombinant par voie intratrachéale à des animaux rendu préalablement expérimentalement allergiques permet d'inhiber le développement de la réaction asthmatique, en diminuant l'inflammation pulmonaire (réduction de l'infiltration éosinophilique, inhibition de la production locale de cytokines Th2) et protège ces derniers contre l'altération de leur fonction respiratoire (protection contre l'hyperréactivité bronchique, avec inhibition de l'hypersécrétion de mucus). Toutefois, les mécanismes cellulaires à l'origine de cette protection sont encore actuellement à l'étude, et semblent indépendants de grandes voies de régulation de la réaction allergique comme les lymphocytes T régulateurs. L'ensemble de ces données permet de mettre en évidence l'importance de certaines voies chimiokiniques dans le contrôle des pathologies Th2, et de démontrer les conséquences fonctionnelles de leur ciblage spécifique (par neutralisation, ou administration), révélant ainsi leur potentiel thérapeutique.LILLE2-BU Santé-Recherche (593502101) / SudocSudocFranceF

Les chimiokines, actrices de la déviation immune

L'immunité peut développer des défenses extrêmement variées adaptées aux caractéristiques de son agresseur. Le choix des stratégies de défense se traduit par la polarisation des cellules T CD4+ naïves en cellules auxiliaires polarisées qui comportent actuellement les lymphocytes TH1 impliqués dans l'immunité cellulaire, TH2 impliqués dans l'immunité humorale, TH17 impliqués dans la défense antibactérienne et l'autoimmunité et les lymphocytes T régulateurs responsables de la tolérance. La polarisation de la réponse immunitaire spécifique est sous l'influence de nombreux facteurs tels que l'antigène, sa dose, son mode d'inoculation et son mode d'infection, le type de cellule dendritique impliquée, les molécules de costimulation et surtout l'environnement cytokinique. L'objectif de ce travail est de montrer que les chimiokines participent, elles aussi, à la polarisation de la réponse immunitaire spécifique en favorisant le recrutement d'un certain type de cellule auxiliaire. Nos travaux portent sur trois chimiokines : CCL5 et son récepteur CCR5, CCL17 et CCL18. Dans les travaux concernant CCL5/CCR5 et CCL17, nous avons utilisé un modèle de souris SCID greffées de peau humaine et reconstituées avec les cellules mononucléées du donneur. La chimiokine est injectée au niveau du greffon cutané et le recrutement cellulaire induit est évalué par immunohistochimie à partir de biopsies cutanées du greffon. Nous avons pu montrer que CCR5 est un récepteur indispensable au recrutement par CCL5 des monocytes/macrophages et des cellules TH1, même si ces cellules expriment d'autres récepteurs pour ce ligand. Concernant CCL17, nous avons montré que cette chimiokine induisait un recrutement préférentiel de cellules TH2 au niveau cutané et était suffisante pour induire le recrutement de cellules CD4+ mémoire au niveau des ganglions drainant de la peau. Ces résultats font de CCL17 un acteur important de l'initiation et du développement des pathologies inflammatoires cutanées associées à des réponses TH2. Les travaux concernant CCL18 ont mis en évidence l'implication de cette chimiokine dans la réponse lymphocytaire TH2 dont l'expression est induite par les cytokines IL-4, IL-13 et IL-10 et qui présente un effet chimiotactique vis-à-vis des cellules TH2 et des basophiles. Elle semble notamment impliquée dans les réactions allergiques puisque nous avons montré une modulation de l'expression de cette chimiokine par l'allergène seulement chez les patients atopiques. D'autre part, CCL18 est surexprimée dans le lavage bronchoalvéolaire des patients asthmatiques allergiques et pas chez les asthmes non allergiques. Le traitement par corticoïdes inhalés normalise le taux de CCL18 dans le lavage bronchoalvéolaire. CCL18 pourrait donc participer à l'inflammation pulmonaire lors des réactions allergiques et notamment à son maintien comme le suggère sa sécrétion tardive. Des résultats préliminaires suggèrent que CCL18 recrute des cellules Treg. Cette chimiokine pourrait donc également jouer un rôle dans la résolution de la réaction allergique. Des études supplémentaires sont nécessaires afin de préciser la fonction biologique de CCL18 en situation physiologique et pathologique. Chez le sujet non allergique, les particules de diesel favorisent le développement de réactions immunitaires de type TH2 en induisant l'expression de CCL18 (pro-TH2) et en diminuant la production d'IP-10 (pro-TH1). D'autre part, les surnagents de culture de cellules mononucléées de patients non-allergiques exposées aux particules de diesel induisent le recrutement de cellules TH2. L'exposition au diesel pourrait donc dévier la réponse immunitaire spécifique vers un profil TH2 et favoriser ainsi le développement de maladies allergiques chez le sujet non atopique. L'ensemble de ces résultats mettent en évidence un rôle de certaines chimiokines dans la déviation de la réponse immune par la sélection du type de cellules T auxiliaires qu'elles recrutent sur le site inflammatoire. Cette donnée en fait des cibles thérapeutiques potentielles.LILLE2-BU Santé-Recherche (593502101) / SudocSudocFranceF

Les chimiokines en physiopathologie pulmonaire (rôle de CCL18)

Les chimiokines sont un élément essentiel du trafic cellulaire aussi bien homéostatique que dans des situations pathologiques. CCL18 est une chimiokine récemment clonée, exprimée préférentiellement au niveau pulmonaire et induite par les cytokines de type Th2 telle que l'IL-4, l'IL-13 et l'IL-10. Ces données nous ont amenés à étudier l'expression et le rôle de CCL18 dans différentes pathologies pulmonaires. Nous nous sommes tout d'abord intéressés à l'implication de CCL18 dans l'asthme allergique, et sa régulation par différents facteurs. Nos études in vitro nous ont permis de montrer que CCL18 est produite de façon tardive par les cellules mononucléées (CMN) de patients allergiques stimulées par l'allergène, en particulier par les cellules dendritiques plasmacytoïdes et par les monocytes via la sécrétion d'IL-4 et d'IL-13. De plus, CCL18 est capable d'attirer les basophiles et les lymphocytes Th2 mais pas les éosinophiles ni les cellules Th1. Les études ex-vivo ont montré que CCL18 est augmenté au niveau du lavage broncho-alvéolaire de sujets asthmatiques non traités par rapport à des sujets contrôles ou asthmatiques traités par des corticoïdes inhalés. Ces résultats suggèrent un rôle de CCL18 dans la réaction allergique. L'effet de corticoïdes sur l'expression de CCL18 a ensuite été analysé. Les patients asthmatiques traités par des corticoïdes ont des taux circulants multipliés par 2,5. Cependant, les patients atteints de broncho-pneumopathie chronique obstructive ont des taux de CCL18 circulant élevés qui ne sont pas modifiés par les corticoïdes. De même, les patients atteints de mucoviscidose ont des taux de CCL18 circulants normaux qui ne sont pas modifiés par les corticoïdes. Dans cette pathologie, CCL18 est corrélé à l'IL-13 sérique. Ces résultats suggèrent une influence des corticoïdes sur la sécrétion de CCL18, données confirmées par une étude in vitro où la sécrétion de CCL18 induite par les cytokines IL-4 et IL-10 est potentialisée par la dexaméthasone, alors qu'elle inhibe la production induite par le LPS. L'effet de facteurs environnementaux et notamment l'exposition au diesel a été évalué. La stimulation de CMN de patients allergiques par le diesel entraîne une augmentation tardive de la sécrétion de CCL18 avec ou sans costimulation allergénique, suggérant un rôle de cette chimiokine dans l'effet du diesel sur la réaction allergique. Enfin, dans le mésothéliome pleural les taux de CCL18 circulants et pleuraux sont élevés. On y constate un déficit en cellules T au niveau pleural avec de forte concentration d'IL-10 et des cellules T régulatrices par rapport aux lésions pleurales bénignes. De plus, CCL18 pleural est corrélé aux cellules NK infiltrées. La présence au niveau local de types cellulaires anti- et pro- tumoraux nécessite une étude approfondie pour déterminer leur fonctionnalité. L'étude de CCL18 in vivo est limitée par l'absence d'homologue murin. Un modèle de souris immuno-déficientes (SCID) greffée avec de la peau humaine a donc été mis au point dans le but de tester l'effet des chimiokines et de leurs récepteurs in vivo. Dans un premier temps, nous avons évalué dans ce modèle la part du CCR5 dans le recrutement leucocytaire induit par CCL5 (RANTES). CCL5 induit un recrutement significatif de cellules T mémoires, de monocytes/macrophages, d'éosinophiles et de cellules IFN-g+ mais pas IL-4+ ou IL-5+. L'inhibition du CCR5 entraîne une inhibition complète du recrutement des monocytes/macrophages et des cellules productrices d'IFN-g, bien qu'elles expriment d'autres récepteurs de CCL5, et n'a pas d'effet sur le recrutement des éosinophiles. Ces résultats suggèrent qu'in vivo l'environnement régule les cibles de CCL5 aboutissant à un recrutement différentiel de cellules. Dans un deuxième temps, nous avons évalué l'effet de CCL18 dans ce modèle, après injection par voie intradermique. Les résultats préliminaires mettent en évidence un recrutement de cellules CD4+CD45RA+, CD4+CD45RO+, CD4+CD25+ et des cellules IL-10+ laissant supposer que, comme in vitro, CCL18 attire les cellules T naïves, mais aussi les mémoires et éventuellement les cellules T régulatrices, ceci restant à confirmer. Le récepteur de CCL18 est encore inconnu, nous nous sommes intéressés au clonage de ce récepteur à l'aide d'une méthode utilisant des molécules produites en cellules eucaryotes. Des vecteurs d'expression de CCL18 et des chimères de CCL18 couplées au fragment Fc de l'IgG1 humaine et murine ont été construits. Ces trois molécules ont été exprimées en cellules eucaryotes CHO et HEK293. Nous nous sommes attachés à mettre au point un système de sécrétion suffisant et une méthode de purification efficace. Ces molécules purifiées serviront ensuite au clonage du récepteur par screening à partir d'une banque d'ADNc.Chemokines are a key factor for cellular traffic in homeostasis or pathological conditions. CCL18 is a chemokine recently cloned, preferentially expressed in lung tissue and induced by Th2-type chemokine like IL-4, IL-13 and IL-10. We studied CCL18 expression and role in different lung pathologies. First, we analysed CCL18 involvement in allergic asthma, and its regulation by several factors. In vitro studies showed that CCL18 was lately produced by mononuclear cells (PBMC) isolated from allergic patients and stimulated by allergen, involving IL-4 and IL-13 production by plasmacytoid dendritic cells and monocytes. CCL18 was able to attract basophiles and Th2 lymphocytes, but not eosinophils and Th1 lymphocytes. Ex vivo studies showed that CCL18 was increased in the bronchoalveolar lavage from non-treated asthmatic patients compared to control subjects or asthmatics treated by inhaled corticoids. These results suggest that CCL18 plays a role in the allergic reaction. Second, corticoid effects on CCL18 production were evaluated. Corticoid treatment induced a 2.5 fold increase in serum CCL18 levels in asthmatic patients, whereas it did not modify them in patients with chronic obstructive pulmonary disease, who exhibit elevated serum CCL18. Serum CCL18 levels were normal in patients with cystic fibrosis, not modified by corticoids, and correlated to serum IL-13. These results suggest that corticoids regulate CCL18 expression depending on the pathology. This observation was confirmed in vitro. Indeed, dexamethasone increased IL-4- and IL-10-induced CCL18 production, but inhibited LPS-induced CCL18 production. Third, the effect of environmental factors, particularly diesel exposure, was analysed. Diesel activation of PBMC from allergic patients induced a late increase in CCL18 exposure, with or without allergen exposure, suggesting a role of this chemokine in the diesel effect on the allergic reaction. Finally, we found increased serum and pleural CCL18 in patients with pleural mesothelioma. In this pathology, T cell number was lower in pleura whereas IL-10 levels and T regulatory cell numbers were higher compared to benign pleural lesions. CCL18 was correlated to the number of infiltrated NK cells. The local presence of pro- and anti-tumoral cells will need further studies to better understand their involvement. Studies to evaluate the in vivo role of CCL18 are limited due to the absence of a murine homologue. Therefore, a model was established in SCID (Sever Combined ImmunoDeficient) mice grafted with human skin in order to analyse the effect of chemokines and their receptors in vivo. We firstly evaluated the role of CCR5 in the CCL5 (RANTES)-induced leukocyte recruitment in this model. CCL5 induced a significant recruitment of memory T cells, monocytes/macrophages, eosinophils and IFN-g+ cells but not IL-4+ or IL-5+ cells. CCR5 inhibition induced a complete inhibition of the recruitment of monocytes/macrophages and IFN-g+ cells, although these cells express other receptors for CCL5, but did not modify eosinophil recruitment. These results suggest that the in vivo environment regulates CCL5 targets, leading to a differential cell recruitment. We secondly analysed the effect of CCL18 after intradermal injection. Preliminary results show a recruitment of CD4+CD45RA+, CD4+CD45RO+, CD4+CD25+ and IL-10+ cells, suggesting that, as shown in in vitro studies, CCL18 attracts naïve T cells but also memory and possibly regulatory T cells, this being to be confirmed. CCL18 receptor is still unknown. Our goal was to clone this receptor using molecules produced in eukaryotic cells. CCL18 expressing vectors and a soluble fusion protein made of CCL18 fused to the Fc portion of human or murine IgG1 was constructed. These molecules were expressed in CHO and HEK293 eukaryotic cell lines. We established methods for sufficient secretion and efficient purification. These purified molecules will be further used for the receptor cloning from a cDNA bank.LILLE2-BU Santé-Recherche (593502101) / SudocSudocFranceF