RNA silencing in the dermatophyte Microsporum canis

Dermatomycoses caused by Microsporum canis are frequent in domestic animals and easily transmissible to humans. Several proteases secreted by this fungus were identified as potential virulence factors, but the construction of deficient strains is required to investigate their role in the pathogenesis of the disease. Using target genes encoding two of these proteases, a first evaluation of the utility of RNA-mediated silencing as a reverse genetic tool in dermatophytes was carried out. SUB3 and DPPIV, respectively coding for a subtilisin and a dipeptidyl peptidase, were both down-regulated, by means of two plasmid constructs designed to express an RNA hairpin that corresponds to part of their respective sequence. The degree of attenuation was evaluated by enzymatic assay of the transformants culture supernatants, and by real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Enzymatic activities and expression levels varied from less than 5% to 100% of that of control transformants obtained with plasmid without hairpin inserts. Inhibition was globally more efficient for SUB3 than for DPPIV. These results show that RNA silencing can be used for functional genomics in M. canis, and particularly to circumvent the limits and technical difficulties of conventional disruption method

RNA silencing in the dermatophyte Microsporum canis

Dermatomycoses caused by Microsporum canis are frequent in domestic animals and easily transmissible to humans. Several proteases secreted by this fungus were identified as potential virulence factors, but the construction of deficient strains is required to investigate their role in the pathogenesis of the disease. Using target genes encoding two of these proteases, a first evaluation of the utility of RNA-mediated silencing as a reverse genetic tool in dermatophytes was carried out. SUB3 and DPPIV, respectively coding for a subtilisin and a dipeptidyl peptidase, were both down-regulated, by means of two plasmid constructs designed to express an RNA hairpin that corresponds to part of their respective sequence. The degree of attenuation was evaluated by enzymatic assay of the transformants culture supernatants, and by real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Enzymatic activities and expression levels varied from less than 5% to 100% of that of control transformants obtained with plasmid without hairpin inserts. Inhibition was globally more efficient for SUB3 than for DPPIV. These results show that RNA silencing can be used for functional genomics in M. canis, and particularly to circumvent the limits and technical difficulties of conventional disruption method

Contribution à l’étude fonctionnelle des dipeptidyl peptidases et de la métalloprotéase MEP3 sécrétées par Microsporum canis

Thèse de Doctorat en Sciences VétérinairesRésuméOrientation: Médecine VétérinaireTitre de la thèse en français:Contribution à l’étude fonctionnelle des dipeptidyl peptidases et de la métalloprotéase MEP3 sécrétées par Microsporum canis »Titre de la thèse en anglais:Contribution to the functional study of dipeptidyl peptidases and MEP3 metalloprotease secreted by Microsporum canisCandidat: Sandy VermoutPromoteur: Dr Bernard MignonCo-promoteur: Prof. Bertrand LossonDépartement et Service: Département des Maladies Infectieuses et Parasitaires, service de Parasitologie et de Pathologie des Maladies Parasitaires Date de la défense publique:Composition du Jury:Description du sujet de recherche abordé:Les dermatophytes sont des champignons filamenteux responsables de mycoses superficielles contagieuses, souvent appelées « teignes », et couramment rencontrées tant en dermatologie humaine que vétérinaire. Parmi eux, Microsporum canis est l’agent isolé dans la majorité des cas de dermatophytose chez le chat et le chien. Le chat peut être considéré comme le réservoir de cette infection, qu’il transmet à différentes espèces animales mais aussi à l’homme.La relation hôte-parasite caractérisant les dermatophytoses est particulière. Les dermatophytes se nourrissent aux dépens même de la barrière kératinisée destinée à la protection de l’organisme contre les agressions extérieures. Ils y restent confinés et sont généralement incapables de provoquer des infections profondes. Les dermatophytes sont des parasites obligatoires, qui affectent des hôtes immunocompétents. Par ailleurs, l’expression clinique des dermatophytoses est très variable selon l’hôte et l’espèce fongique impliqués : l’infection peut être aiguë et rapidement éliminée, ou au contraire persistante et accompagnée de symptômes ténus. Par exemple, les lésions causées par M. canis sont généralement plus inflammatoires chez l’homme que chez le chat, son hôte naturel, et certains chats développent des teignes chroniques peu apparentes, jouant un rôle important dans la transmission de l’infection.Les mécanismes qui président à ces divers aspects de la pathogenèse des dermatophytoses, et en particulier de l’infection par M. canis, restent très mal connus. La majeure partie des recherches effectuées jusqu’à ce jour concernent les nombreuses protéases sécrétées par les dermatophytes et potentiellement impliquées dans le dégradation de la kératine, si bien qu’un grand nombre d’entre elles ont été caractérisées d’un point de vue moléculaire et enzymatique. Chez M. canis, deux familles de gènes, codant respectivement pour des subtilases (SUBs) et des métalloprotéases (MEPs), ont été isolées (Brouta et al., 2002 ; Descamps et al., 2002 ; Jousson et al., 2004). Parmi leurs membres, SUB3 et MEP3 sont considérées comme de probables facteurs de virulence ; en effet, elles sont induites sur un milieu à base de poils de chats, exprimées in vivo, fortement kératinolytiques, et également immunogènes (Descamps et al., 2003a ; Brouta et al., 2003). Le premier objectif de ce travail est d’évaluer l’immunogénicité et le pouvoir protecteur de MEP3 sous forme recombinante, dans le cadre d’un essai de vaccination chez le cobaye. Le second est d’identifier et de caractériser chez M. canis une autre classe de protéases, les dipeptidyl peptidases (DPPs). Les gènes correspondants seront isolés et séquencés, ce qui permettra l’étude de leur expression in vivo et sur différents milieux in vitro. Les protéines encodées seront produites sous forme recombinante, afin de pouvoir entamer l’analyse de leurs propriétés enzymatiques et immunologiques. Enfin, étant donné que chaque facteur étudié ne peut être formellement impliqué dans la virulence du champignon qu’en passant par la construction de souches déficientes, le troisième but de ce doctorat est de mettre au point chez M. canis une technique d’inactivation génique par l’intermédiaire d’ARNs en épingle à cheveux, en utilisant comme cibles des gènes codant pour des protéases sécrétées. Résultats:Un vaccin expérimental anti-M. canis a été préparé en associant MEP3, obtenue sous forme recombinante dans la levure Pichia pastoris (rMEP3), à l’adjuvant de Freund. Le vaccin a été administré à des cobayes, par voie sous-cutanée, trois fois à 15 jours d’intervalle. La vaccination a induit une forte réponse en anticorps spécifiques, ainsi qu’une réponse lymphoproliférative envers MEP3. Toutefois, cette dernière est apparue comme transitoire, puisqu’elle n’était plus significative au moment de l’épreuve d’infection. Celle-ci a eu lieu 7 semaines après la dernière vaccination. L’évolution clinique de l’infection, ainsi que la persistance du champignon, ont été suivies de façon régulière et exprimées sous forme de scores clinique et mycologique attribués à chaque animal. Aucune différence significative n’a pu être mise en évidence entre les scores des animaux vaccinés et non vaccinés. La réponse en anticorps induite par l’infection chez les animaux non vaccinés s’est révélée nettement plus faible que celle induite par la vaccination ; la réponse lymphoproliférative observée après l’infection était d’intensité comparable entre animaux vaccinés et non vaccinés. Le vaccin à base de rMEP3 n’a donc pas été protecteur, malgré l’induction d’une importante réponse humorale et le recrutement de cellules T spécifiques.Dans le but d’identifier de nouveaux immunogènes potentiels, et de compléter dans le même temps les connaissances relatives aux protéases sécrétées par M. canis, les gènes codant pour des dipeptidyl peptidases ont été isolés. Il s’agit d’exoprotéases libérant des dipeptides au niveau de l’extrémité N-terminale des protéines et réparties en différentes classes suivant la nature de ce dipeptide et suivant leur localisation cellulaire. Deux gènes uniques, codant respectivement pour une DPPIV et une DPPV, ont pu être isolés, séquencés et caractérisés. Ils encodent des protéases de la famille S9 de protéases à sérine, possédant un peptide signal de sécrétion mais pas de séquence pro-, et possédant des sites de glycosylation. Les deux protéases sont à 90% identiques à leurs paralogues isolés chez Trichophyton rubrum (Monod et al., 2005), un dermatophyte fréquemment isolé lors de dermatophytose humaine. Elles sont également homologues aux DPPs d’Aspergillus fumigatus, qui ont été proposées comme facteurs de virulence potentiels (Beauvais et al., 1997a,b). La DPPIV de M. canis présente également un degré d’homologie élevé avec la DPPIV de la bactérie pathogène Porphyromonas gingivalis, qui est un facteur de virulence avéré (Kumagai et al., 2003), ainsi qu’avec le marqueur mammalien CD26, qui est une molécule multifonctionnelle participant à de nombreux processus biologiques et immunologiques (Boonacker et Van Noorden, 2003). Grâce à une technique de RT-PCR (Reverse Transcription-PCR) en temps réel, une importante augmentation de l’expression des deux DPPs de M. canis a été mise en évidence lorsque le champignon est cultivé sur des milieux constitués de protéines de matrice extracellulaire, parmi lesquelles la kératine. L’expression des DPPs a également été détectée in vivo, chez le chat et le cobaye, par RT-PCR nichée. Les deux protéases ont été produites sous forme recombinante dans la levure P. pastoris, et y sont enzymatiquement actives. Les DPPs recombinantes apparaissent sous forme d’une bande à 83 kDa (DPPV) et d’un doublet à 95 et 98 kDa (DPPIV), dont respectivement 5 kDa et 9 ou 12 kDa de glycosylation. Elles clivent les substrats préférentiels de leurs sous-familles enzymatiques, ce qui correspond dans le cas de la DPPIV aux liens de type Proline-X ; cette spécificité est très rarement rencontrée parmi les protéases. Alors qu’aucune des deux DPPs de M. canis n’est à elle seule kératinolytique, l’implication de la DPPIV dans la digestion du réseau de kératine a été testée en utilisant le substrat Keratin Azure (Sigma) et des surnageants de cultures de M. canis montrant une forte activité kératinolytique. La préincubation de ces surnageants avec un inhibiteur spécifique de DPPIV n’a eu aucun effet sur le niveau de solubilisation du substrat kératinisé. Ce résultat indique que l’intervention potentielle de la DPPIV dans cette digestion a lieu uniquement en aval de la digestion par les endoprotéases. Ensuite, dans le but d’évaluer la capacité de la DPPV d’induire une réponse cutanée de type DTH (Delayed Type Hypersensitivity), sa forme recombinante a été utilisée dans le cadre de tests d’intradermoréaction chez des cobayes précédemment infectés par M. canis. La réaction s’est avérée négative, contrairement à ce qui a été observé dans le cas de la DPPV de Trichophyton tonsurans chez l’homme. Toutefois, cette dernière a été utilisée sous sa forme native. Enfin, une technique d’inactivation génique via l’ARN a été mise au point chez M. canis, en utilisant comme cibles les gènes codant pour SUB3 et DPPIV. Il s’agit de la première mise en œuvre de cette méthodologie chez les dermatophytes. La technique employée dérive du phénomène d’ « interférence à l’ARN » (RNA interference, RNAi), qui a lieu à proprement parler dans les cellules animales, mais équivaut à des voies similaires chez les autres types d’organismes, y compris les champignons (Nakayashiki, 2005). L’interférence à l’ARN a pour élément déclencheur un ARN double brin, qui entraîne la destruction enzymatique des ARN messagers de séquence identique. Chez les champignons filamenteux, cette voie est activée efficacement par un ARN en épingle à cheveux d’une taille de 500 à 1000 bp. Nous avons donc conçu deux constructions codant pour de telles épingles à cheveux, dont les séquences correspondent respectivement à un fragment des gènes SUB3 et DPPIV. M. canis a ensuite été transformé, séparément, par chacune de ces constructions. Pour chaque gène cible, les souches fongiques générées ont présenté des degrés d’inhibition variables, évalués par RT-PCR en temps réel et par mesure de l’activité enzymatique des protéines cibles dans les surnageants de culture des transformants. Les taux d’activité enzymatique résiduelle et d’ARN messager obtenus étaient respectivement de 3,3% et 2% pour SUB3, et de 45,6% et 1,5% pour DPPIV. La distribution des taux d’inhibition génique entre 0% et plus de 95% est compatible avec les résultats d’études similaires chez d’autres champignons filamenteux. En outre, dans le cas de l’atténuation de l’expression de SUB3, une analyse par électrophorèse SDS-PAGE du surnageant de culture d’une souche fortement inhibée montre la disparition de la bande correspondant à SUB3, mais aussi de celle correspondant à SUB4, ce qui indique que le seul fragment interférant utilisé est potentiellement capable d’inhiber plusieurs gènes de la même famille. Conclusions et perspectives:Aucune atténuation des symptômes de l’infection par M. canis, ni de l’invasion par le champignon, n’est obtenue en vaccinant des cobayes avec rMEP3 associée à l’adjuvant de Freund selon le protocole utilisé. Des résultats similaires ont été obtenus avec deux autres protéases recombinantes, SUB3 chez M. canis (Descamps et al., 2003b) et la hsp60 de T. rubrum (Raska et al., 2004). Or, le succès d’un vaccin résulte à la fois des propriétés intrinsèques du ou des immunogènes qu’il contient, et de la stimulation sélective par son adjuvant des acteurs efficaces de la réponse immune. Deux options sont donc offertes pour de nouvelles recherches dans le domaine de la vaccination anti-M. canis et anti-dermatophytes. La première consiste à poursuivre la dissection de la réponse immune spécifique en étudiant les propriétés immunogènes de composants particuliers. Même si l’élimination naturelle d’une infection fongique relève généralement d’une réponse effectrice cellulaire de type Th1, cette perspective va bien au-delà de la recherche d’un facteur activant des lymphocytes Th1, ou rappelant une réponse de type DTH au niveau cutané. En effet, il est actuellement démontré que des anticorps de spécificité bien choisie peuvent être totalement protecteurs contre une infection fongique (Casadevall et al., 2002 ; Cassone, 2007). En outre, il ne faut pas perdre de vue que l’élément fongique de base déterminant une réponse immune adéquate est l’épitope (Woodfolk et al., 2000). Le répertoire d’épitopes générés à partir d’une protéase recombinante peut d’ailleurs être modifié par rapport à son homologue native (Engelhard et al., 2006), comme cela est suspecté pour rDPPV chez M. canis. Ce phénomène peut engendrer une altération des propriétés immunogènes natives, mais a contrario, une protéase recombinante ainsi modifiée peut devenir un outil pour identifier des motifs antigéniques d’intérêt. La seconde voie possible vers l’élaboration d’un vaccin sûr et pleinement efficace est l’utilisation de nouveaux adjuvants orientant la réponse immune de la même façon qu’une infection naturelle protectrice. Chez A. fumigatus, des oligonucléotides CpG associés à une protéine recombinante ont permis de protéger des souris contre une aspergillose invasive, en stimulant plusieurs composants de la réponse cellulaire de type Th1 (Bozza et al., 2002). La vaccination à base de cellules dendritiques polarisées par un contact avec A. fumigatus s’est également montrée prometteuse dans un modèle murin d’aspergillose invasive (Bozza et al., 2004), cette technique pouvant être assimilée à l’emploi d’un adjuvant de nouvelle génération. Il est bien entendu que ces deux voies de recherche ne s’excluent pas mutuellement, et qu’un travail mené dans les deux directions sera sans doute nécessaire pour atteindre le but recherché.Les DPPIV et V de M. canis ont été caractérisées au niveau moléculaire, et exprimées sous forme recombinante active. Leurs propriétés ainsi que celles de différentes protéases homologues laissent supposer qu’elles jouent un rôle universel dans la digestion de substrats protéiques complexes, y compris les structures kératinisées, mais qu’elles pourraient en plus avoir acquis une ou plusieurs fonctions spécialisées dans le cadre de la relation hôte-parasite. L’une de ces fonctions pourrait être la modulation de la réponse immune, par exemple via le clivage de cytokines ou de chémokines, étant donné notamment sa similitude avec la DPPIV mammalienne ou CD26. Parallèlement, les DPPs sont peut-être aussi des immunogènes importants. Enfin, la DPPIV sécrétée par M. canis pourrait intervenir dans l’adhérence aux protéines de matrice extracellulaire, ou encore dans la dégradation des tissus via l’activation de protéases de l’hôte, comme cela a été démontré chez P. gingivalis (Kumagai et al., 2005). Plusieurs perspectives sont donc ouvertes quant à l’investigation de la fonction des DPPs des dermatophytes, et certaines pourront êtres rencontrées grâce aux formes recombinantes de ces protéines. Cependant, pour elles comme pour tous les autres facteurs fongiques susceptibles de contribuer à la pathogenèse des dermatophytoses, la construction de souches déficientes est un passage obligé vers la démonstration formelle de cette contribution. Ceci est maintenant réalisable rapidement, au moyen de constructions exprimant des ARN double brin interférants, même si de nombreuses améliorations peuvent sans doute être apportées à cette technique. Les souches déficientes au niveau de SUB3 et potentiellement des autres SUBs, ainsi que celles déficientes au niveau de DPPIV, seront prochainement évaluées quant à leur comportement dans un modèle d’épiderme félin reconstitué mis au point dans notre laboratoire (Tabart et al., sous presse).Références:BEAUVAIS A., MONOD M., DEBEAUPUIS J.-P., DIAQUIN M., KOBAYASHI H., LATGE J.-P. Biochemical and antigenic characterization of a new dipeptidyl-peptidase isolated from Aspergillus fumigatus. J. Biol. Chem., 1997a, 272, 6238-44.BEAUVAIS A., MONOD M., WYNIGER J., DEBEAUPUIS J.-P., GROUZMANN E., BRAKCH N., SVAB J., HOVANESSIAN A.G., LATGE J.-P. Dipeptidyl-peptidase IV secreted by Aspergillus fumigatus, a fungus pathogenic to humans. Infect. Immun., 1997b, 65, 3042-7. BOONACKER E., VAN NOORDEN C.J. The multifunctional or moonlighting protein CD26/DPPIV. Eur. J. 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Soumis pour publication.Remerciements:Fonds pour la formation à la Recherche dans l’Industrie et l’Agriculture (F.R.I.A.)Fonds pour la Recherche Scientifique et Médicale (F.R.S.M.)Patrimoine de l’Université de Lièg

Evidence for acquisition of virulence effectors in pathogenic chytrids

Background The decline in amphibian populations across the world is frequently linked to the infection of the chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis (Bd). This is particularly perplexing because Bd was only recently discovered in 1999 and no chytrid fungus had previously been identified as a vertebrate pathogen. Results In this study, we show that two large families of known virulence effector genes, crinkler (CRN) proteins and serine peptidases, were acquired by Bd from oomycete pathogens and bacteria, respectively. These two families have been duplicated after their acquisition by Bd. Additional selection analyses indicate that both families evolved under strong positive selection, suggesting that they are involved in the adaptation of Bd to its hosts. Conclusions We propose that the acquisition of virulence effectors, in combination with habitat disruption and climate change, may have driven the Bd epidemics and the decline in amphibian populations. This finding provides a starting point for biochemical investigations of chytridiomycosis

Identification and Characterization of Prokaryotic Dipeptidyl-Peptidase 5 from Porphyromonas gingivalis

Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative asaccharolytic anaerobe, is one of the major causative organisms of chronic periodontitis. The bacterium utilizes amino acids as energy and carbon sources, and incorporates them mainly as dipeptides. Therefore, a wide variety of dipeptide production processes mediated by dipeptidyl-peptidases (DPPs) should be beneficial for the organism. In the present study, we identified the fourth P. gingivalis enzyme, DPP5. A DPP7-like activity still remained in a dpp4-7-11 disrupted P. gingivalis ATCC 33277. PGN_0756, currently annotated as a prolyl oligopeptidase, possessed an activity indistinguishable from that of the triple dpp gene-disrupted strain, and was identified as a bacterial orthologue of fungal DPP5, because of its substrate specificity and 28.5% amino acid sequence identity with an Aspergillus fumigatus entity. P. gingivalis DPP5 was composed of 684 amino acids with an apparent molecular weight of 66 kDa, while it preferred Ala and hydrophobic residues, had no activity toward Pro at the P1 position, and no preference for hydrophobic P2 residues, showed an optimal pH of 6.7 in the presence of NaCl, demonstrated kcat/Km values for Gly-Phe-MCA and Lys-Ala-MCA of 13.01 and 11.02 μM-1 s-1, respectively, and was localized in the periplasm. DPP5 elaborately complemented DPP7 in liberation of dipeptides with hydrophobic P1 residues. Examinations of dpp- and gingipain gene-disrupted mutants indicated that DPP4, DPP5, DPP7, and DPP11 together with Arg- and Lys-gingipains cooperatively liberate most dipeptides from nutrient oligopeptides. This is the first study to report that DPP5 is expressed not only in eukaryotes, but also distributed in prokaryotes

Identification of Dipeptidyl-Peptidase (DPP)5 and DPP7 in Porphyromonas endodontalis, Distinct from Those in Porphyromonas gingivalis

Dipeptidyl peptidases (DPPs) that liberate dipeptides from the N-terminal end of oligopeptides are crucial for the growth of Porphyromonas species, anaerobic asaccharolytic gram negative rods that utilize amino acids as energy sources. Porphyromonas endodontalis is a causative agent of periapical lesions with acute symptoms and Asp/Glu-specific DPP11 has been solely characterized in this organism. In this study, we identified and characterized two P. endodontalis DPPs, DPP5 and DPP7. Cell-associated DPP activity toward Lys-Ala-4-methylcoumaryl-7- amide (MCA) was prominent in P. endodontalis ATCC 35406 as compared with the Porphyromonas gingivalis strains ATCC 33277, 16-1, HW24D1, ATCC 49417, W83, W50, and HNA99. The level of hydrolysis of Leu-Asp-MCA by DPP11, Gly- Pro-MCA by DPP4, and Met-Leu-MCA was also higher than in the P. gingivalis strains. MER236725 and MER278904 are P. endodontalis proteins belong to the S9- and S46-family peptidases, respectively. Recombinant MER236725 exhibited enzymatic properties including substrate specificity, and salt- and pH-dependence similar to P. gingivalis DPP5 belonging to the S9 family. However, the kcat/Km figure (194 mM21?sec21) for the most potent substrate (Lys-Ala-MCA) was 18.4-fold higher as compared to the P. gingivalis entity (10.5 mM21?sec21). In addition, P. endodontalis DPP5 mRNA and protein contents were increased several fold as compared with those in P. gingivalis. Recombinant MER278904 preferentially hydrolyzed Met-Leu-MCA and exhibited a substrate specificity similar to P. gingivalis DPP7 belonging to the S46 family. In accord with the deduced molecular mass of 818 amino acids, a 105-kDa band was immunologically detected, indicating that P. endodontalis DPP7 is an exceptionally large molecule in the DPP7/DPP11/S46 peptidase family. The enhancement of four DPP activities was conclusively demonstrated in P. endodontalis, and remarkable Lys-Ala-MCAhydrolysis was achieved by qualitative and quantitative potentiation of the DPP5 molecule