Der Vergleich der Makrophagen-Zelllinien RAW264.7 und P388D1 hinsichtlich ihrer Eignung als Zellkulturmodell für den Einfluss mehrfach ungesättigter Fettsäuren

Einleitung: Makrophagen spielen eine vitale Rolle im angeborenen und adaptiven Immunsystem. Neben ihrer Rolle als Phagozyten bilden sie eine Reihe reaktiver Sauerstoff - und Stickstoff - Intermediate sowie immunmodulierender Zytokine. Ein wichtiger Faktor für die Makrophagen - Funktion ist die Ernährung, da sie unmittelbare Auswirkungen auf die Membranzusammensetzung hat. Hier gibt es einen direkten Zusammenhang zwischen Ernährung und Entzündung. Eine Untersuchung, die entsprechende Zusammenhänge im vergleichenden Makrophagen - Modell klar herausstellt, fehlt bislang. Ziele der Untersuchungen: Ziel dieser Studie war es, die Eignung zweier Zelllinien für die Analyse des Einflusses von mehrfach ungesättigten Fettsäuren auf verschiedene funktionelle und strukturelle Parameter von Makrophagen zu untersuchen. Material und Methoden: Die Kultur zweier permanenter Maus - Makrophagen - Zelllinien P388D1 und RAW264.7 in RPMI1640 erfolgte mit unterschiedlichen Fettsäuregehalten über 72 Stunden. Es wurden entweder 2μM LA (Linolsäure) und 15 μM LNA (Linolensäure) oder 15 μM LA und 2 μM LNA für die Anreicherung verwendet. Die Kontrolle wurde mit 2μM LA und 2μM LNA supplementiert. Die Fettsäureaufnahme und deren Metabolismus wurden gaschromatografisch bestimmt. Für die Analyse der NADPH - Oxidase - Aktivität wurden die Zellen mit PMA (Phorbol - Myristat - Azetat) stimuliert und die Extinktion von Nitroblautetrazolium gemessen. Als Negativkontrolle wurde DPI (Diphenyleniodoniumchlorid), ein NADPH - Oxidase - Inhibitor verwendet. Zur Analyse der Aktivität der iNOS (induzierbare - Stickstoffmonoxid - Synthase) sind die Zellen mit 50U IFN-γ (Interferron- Gamma) über 24h vorbereitet worden, um dann mit 1μg/μl LPS (Lipopolysaccharid) über weitere 24 h stimuliert zu werden. In den Überständen wurde nachfolgend Nitrit nachgewiesen. Die Messung der Expression der Induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase erfolgte mittels RT- PCR nach oben beschriebener Stimulation. Für die Analyse der Zytokine mit geeigneten murinen EILSA Kits wurden die Zellen wie oben beschrieben vorbereitet und stimuliert. TNF-α (Tumornekrosefaktor-alpha), IL-6 (Interleukin-6) und IL-10 (Interleukin-10) konnte so in den Überständen nachgewiesen werden. Die statistischen Auswertungen erfolgten als einfache Analyse der Varianz, gefolgt von einem Bonferroni-Test, um signifikante Unterschiede zwischen den Mittelwerten zu identifizieren. In allen Fällen wurde das Signifikanzniveau p< 0,05 angenommen. Ergebnisse: Alle Fettsäuren wurden von den Zellen aufgenommen, strukturell integriert u nd metabolisiert. Unter der Stimulation mit PMA kam es bei RAW264.7 zu einem signifikanten Anstieg der NADPH - Oxidase - Aktivität. Im Gegensatz dazu konnte bei P388D1 kein Effekt von PMA auf die Aktivität der NADPH-Oxidase-Aktivität nachgewiesen werden. Die Stickstoffmonoxid Produktion und die Induktion der iNOS konnten bei RAW264.7 durch Stimulation signifikant erhöht werden. In P388D1 war abseits der moderaten Induktion der iNOS keine Veränderung von NO (Stickstoffmonoxid) messbar. RAW264.7 zeigten eine signifikante Änderung der Gehalte an TNF-α, IL-6 und IL-10. P388D1 bildete ebenfalls moderat erhöht TNF-α und IL-6. Die Bildung von IL-10 konnte bei P388D1 jedoch nicht nachgewiesen werden. In der Linie RAW264.7 erhöhte LNA die NADPH-Oxidase-Aktivität signifikant gegenüber LA und der Kontrolle. LA und LNA bewirkten signifikant erhöhte Gehalte des Zytokins IL-10. Die Analyse von TNF-α und IL-6 ergab unter Einwirkung von LA und LNA reduzierte Gehalte beider Mediatoren. Schlussfolgerungen: In Summe zeigen die Versuche, dass sich die Zelllinie RAW264.7 für die Analyse von Vorgängen immunologischer, funktioneller und struktureller Parameter in Bezug auf unterschiedliche PUFA (mehrfach ungesättigte Fettsäuren) Supplementierungen besser eignen als P388D1. Ferner kann resümiert werden, das n3 Fettsäuren-reiche Versorgung einen positiven Einfluss auf die Reaktionsfähigkeit der Makrophagen in puncto Radikalbildung und antiinflammatorischer Wirkung zeigt.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Makrophagen 2.1.1 Entwicklung und Morphologie 2.1.2 Funktionelle und phänotypische Eigenschaften 2.2 Makrophagen-Zelllinien 2.2.1 RAW 264.7 2.2.2 P388 D1 2.3 Makrophagen-Stimulation 2.3.1 Phorbol-12-Myristat-13-Azetat 2.3.2 LPS 2.3.3 Interferon-γ 2.4 Reaktive Moleküle 2.5 Reaktive Sauerstoffspezies 2.5.1 Reaktive Sauerstoffspezies in Makrophagen 2.5.2 Enzymatische Bildung von ROS in Makrophagen 2.6 Wirkungen reaktiver Sauerstoffspezies 2.6.1 Phagozytose 2.6.2 Signalwirkung 2.7 Schutzmaßnahmen der Makrophagen gegenüber reaktiven Sauerstoffspezies 2.7.1 Katalase 2.7.2 Superoxid-Dismutase 2.7.3 Glutathion System 2.8 Reaktive Stickstoffspezies 2.8.1 Reaktive Stickstoffspezies in Makrophagen 2.8.2 Stickstoffmonoxid 2.8.3 Wirkungen reaktiver Stickstoffspezies 2.8.4 Schutzmaßnahmen der Zelle gegenüber reaktiven Stickstoffspezies 2.9 Langkettige Fettsäuren 2.9.1 Essenzielle Fettsäuren 2.9.2 Bedeutung mehrfach ungesättigter Fettsäuren 3 Zielstellung 4 Eigene Untersuchungen 4.1 Material 4.2 Methoden 4.2.1 Kultur P388D 1 und RAW264.7 4.2.2 Zusammensetzung der Zellkulturmedien 4.2.3 Anzüchtung 4.2.4 Dauerkultivierung P388D1 und RAW264.7 4.2.5 Einbaukontrolle der Fettsäuresupplementierung 4.2.6 Mycoplasmentest 4.2.7 Auswertung des Mycoplasmennachweis 4.2.8 Nachweis reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies 4.2.9 NADPH Oxidase-Nachweis 4.2.10 Stickstoffmonoxid-Test mittels Griess Reagenz 4.2.11 Nachweis der Induktion von iNOS 4.2.12 Bestimmung der Zytokine 4.2.13 Statistische Analyse 5 Ergebnisse 5.1 Publikation 1 5.2 Publikation 2 6 Diskussion 6.1 Verschiedene Makrophagen-Modelle und deren Eignung für die biochemische Forschung 6.2 Fettsäuremetabolismus von Makrophagen 6.3 Die Stimulation von Makrophagen und die dabei auftretenden Unterschiede zwischen RAW264.7 und P388D1 6.4 Auswirkung von unterschiedlichen Fettsäuresupplementierungen auf die Aktivität von Makrophagen 7 Schlussfolgerung 8 Zusammenfassung 9 Summary 10 Literaturverzeichnis 11 Anhang 11.1 Die Kultur von P388D 1 und RAW264.7 11.1.1 Gefrierkonservierung 11.1.2 Vitalitätstest mittels Trypanblau 11.2 Ergebnisse der NADPH Oxidase Aktiviät von P388D1 11.3 Materialien 11.3.1 Chemikalien 11.3.2 Verbrauchsmaterialien 11.3.3 verwendete Geräte 11.3.4 verwendete Puffer und Lösungen 11.3.5 verwendete Primer 11.3.6 verwendete Antikörper 12 Danksagun

The Small Colony Variant of<i> Listeria monocytogenes</i> Is More Tolerant to Antibiotics and Has Altered Survival in RAW 264.7 Murine Macrophages

Small Colony Variant (SCV) cells of bacteria are a slow-growing phenotype that result from specific defects in the electron transport chain. They form pinpoint colonies on agar plates and have a variety of phenotypic characteristics, such as altered carbon metabolism, decreased toxin and lytic enzyme production, aminoglycoside resistance, and increased intracellular persistence. They are clinically relevant in Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa, serving as a reservoir for recurrent or prolonged infections. Here, we found that a SCV mutant in the foodborne pathogen Listeria monocytogenes (strain SCV E18), similar to the high persister mutant phenotype, survived significantly better than the wild type when exposed over a 48-h period to concentrations above Minimal Inhibitory Concentration for most tested antibiotics. SCV E18 survived more poorly than the wildtype in unactivated RAW264.7 macrophage cells, presumably because of its reduced listeriolysin O expression, however, it survived better in reactive oxygen species producing, phorbol 12-myristate 13-acetate-activated macrophages. Although SCV E18 was sensitive to oxygen as it entered the stationary phase, it was significantly more tolerant to H(2)O(2) than the wild type, which may result from a shift in metabolism, however, further investigation is needed to resolve this. SCV E18 is a spontaneous mutant with a point mutation in the hemA gene. A wild type copy of hemA was complemented on plasmid pSOG30222, which restored the wild type phenotype. The results reported here suggest that the SCV of L. monocytogenes could be of clinical importance and highlight a need for adequate clinical screening for this phenotype, as it could affect antibiotic treatment outcomes

The Impact of Membrane Lipid Composition on Macrophage Activation in the Immune Defense against Rhodococcus equi and Pseudomonas aeruginosa

Nutritional fatty acids are known to have an impact on membrane lipid composition of body cells, including cells of the immune system, thus providing a link between dietary fatty acid uptake, inflammation and immunity. In this study we reveal the significance of macrophage membrane lipid composition on gene expression and cytokine synthesis thereby highlighting signal transduction processes, macrophage activation as well as macrophage defense mechanisms. Using RAW264.7 macrophages as a model system, we identified polyunsaturated fatty acids (PUFA) of both the n-3 and the n-6 family to down-regulate the synthesis of: (i) the pro-inflammatory cytokines IL-1β, IL-6 and TNF-α; (ii) the co-stimulatory molecule CD86; as well as (iii) the antimicrobial polypeptide lysozyme. The action of the fatty acids partially depended on the activation status of the macrophages. It is particularly important to note that the anti-inflammatory action of the PUFA could also be seen in case of infection of RAW264.7 with viable microorganisms of the genera R. equi and P. aeruginosa. In summary, our data provide strong evidence that PUFA from both the n-3 and the n-6 family down-regulate inflammation processes in context of chronic infections caused by persistent pathogens

Der Vergleich der Makrophagen-Zelllinien RAW264.7 und P388D1 hinsichtlich ihrer Eignung als Zellkulturmodell für den Einfluss mehrfach ungesättigter Fettsäuren

Einleitung: Makrophagen spielen eine vitale Rolle im angeborenen und adaptiven Immunsystem. Neben ihrer Rolle als Phagozyten bilden sie eine Reihe reaktiver Sauerstoff - und Stickstoff - Intermediate sowie immunmodulierender Zytokine. Ein wichtiger Faktor für die Makrophagen - Funktion ist die Ernährung, da sie unmittelbare Auswirkungen auf die Membranzusammensetzung hat. Hier gibt es einen direkten Zusammenhang zwischen Ernährung und Entzündung. Eine Untersuchung, die entsprechende Zusammenhänge im vergleichenden Makrophagen - Modell klar herausstellt, fehlt bislang. Ziele der Untersuchungen: Ziel dieser Studie war es, die Eignung zweier Zelllinien für die Analyse des Einflusses von mehrfach ungesättigten Fettsäuren auf verschiedene funktionelle und strukturelle Parameter von Makrophagen zu untersuchen. Material und Methoden: Die Kultur zweier permanenter Maus - Makrophagen - Zelllinien P388D1 und RAW264.7 in RPMI1640 erfolgte mit unterschiedlichen Fettsäuregehalten über 72 Stunden. Es wurden entweder 2μM LA (Linolsäure) und 15 μM LNA (Linolensäure) oder 15 μM LA und 2 μM LNA für die Anreicherung verwendet. Die Kontrolle wurde mit 2μM LA und 2μM LNA supplementiert. Die Fettsäureaufnahme und deren Metabolismus wurden gaschromatografisch bestimmt. Für die Analyse der NADPH - Oxidase - Aktivität wurden die Zellen mit PMA (Phorbol - Myristat - Azetat) stimuliert und die Extinktion von Nitroblautetrazolium gemessen. Als Negativkontrolle wurde DPI (Diphenyleniodoniumchlorid), ein NADPH - Oxidase - Inhibitor verwendet. Zur Analyse der Aktivität der iNOS (induzierbare - Stickstoffmonoxid - Synthase) sind die Zellen mit 50U IFN-γ (Interferron- Gamma) über 24h vorbereitet worden, um dann mit 1μg/μl LPS (Lipopolysaccharid) über weitere 24 h stimuliert zu werden. In den Überständen wurde nachfolgend Nitrit nachgewiesen. Die Messung der Expression der Induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase erfolgte mittels RT- PCR nach oben beschriebener Stimulation. Für die Analyse der Zytokine mit geeigneten murinen EILSA Kits wurden die Zellen wie oben beschrieben vorbereitet und stimuliert. TNF-α (Tumornekrosefaktor-alpha), IL-6 (Interleukin-6) und IL-10 (Interleukin-10) konnte so in den Überständen nachgewiesen werden. Die statistischen Auswertungen erfolgten als einfache Analyse der Varianz, gefolgt von einem Bonferroni-Test, um signifikante Unterschiede zwischen den Mittelwerten zu identifizieren. In allen Fällen wurde das Signifikanzniveau p< 0,05 angenommen. Ergebnisse: Alle Fettsäuren wurden von den Zellen aufgenommen, strukturell integriert u nd metabolisiert. Unter der Stimulation mit PMA kam es bei RAW264.7 zu einem signifikanten Anstieg der NADPH - Oxidase - Aktivität. Im Gegensatz dazu konnte bei P388D1 kein Effekt von PMA auf die Aktivität der NADPH-Oxidase-Aktivität nachgewiesen werden. Die Stickstoffmonoxid Produktion und die Induktion der iNOS konnten bei RAW264.7 durch Stimulation signifikant erhöht werden. In P388D1 war abseits der moderaten Induktion der iNOS keine Veränderung von NO (Stickstoffmonoxid) messbar. RAW264.7 zeigten eine signifikante Änderung der Gehalte an TNF-α, IL-6 und IL-10. P388D1 bildete ebenfalls moderat erhöht TNF-α und IL-6. Die Bildung von IL-10 konnte bei P388D1 jedoch nicht nachgewiesen werden. In der Linie RAW264.7 erhöhte LNA die NADPH-Oxidase-Aktivität signifikant gegenüber LA und der Kontrolle. LA und LNA bewirkten signifikant erhöhte Gehalte des Zytokins IL-10. Die Analyse von TNF-α und IL-6 ergab unter Einwirkung von LA und LNA reduzierte Gehalte beider Mediatoren. Schlussfolgerungen: In Summe zeigen die Versuche, dass sich die Zelllinie RAW264.7 für die Analyse von Vorgängen immunologischer, funktioneller und struktureller Parameter in Bezug auf unterschiedliche PUFA (mehrfach ungesättigte Fettsäuren) Supplementierungen besser eignen als P388D1. Ferner kann resümiert werden, das n3 Fettsäuren-reiche Versorgung einen positiven Einfluss auf die Reaktionsfähigkeit der Makrophagen in puncto Radikalbildung und antiinflammatorischer Wirkung zeigt.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Makrophagen 2.1.1 Entwicklung und Morphologie 2.1.2 Funktionelle und phänotypische Eigenschaften 2.2 Makrophagen-Zelllinien 2.2.1 RAW 264.7 2.2.2 P388 D1 2.3 Makrophagen-Stimulation 2.3.1 Phorbol-12-Myristat-13-Azetat 2.3.2 LPS 2.3.3 Interferon-γ 2.4 Reaktive Moleküle 2.5 Reaktive Sauerstoffspezies 2.5.1 Reaktive Sauerstoffspezies in Makrophagen 2.5.2 Enzymatische Bildung von ROS in Makrophagen 2.6 Wirkungen reaktiver Sauerstoffspezies 2.6.1 Phagozytose 2.6.2 Signalwirkung 2.7 Schutzmaßnahmen der Makrophagen gegenüber reaktiven Sauerstoffspezies 2.7.1 Katalase 2.7.2 Superoxid-Dismutase 2.7.3 Glutathion System 2.8 Reaktive Stickstoffspezies 2.8.1 Reaktive Stickstoffspezies in Makrophagen 2.8.2 Stickstoffmonoxid 2.8.3 Wirkungen reaktiver Stickstoffspezies 2.8.4 Schutzmaßnahmen der Zelle gegenüber reaktiven Stickstoffspezies 2.9 Langkettige Fettsäuren 2.9.1 Essenzielle Fettsäuren 2.9.2 Bedeutung mehrfach ungesättigter Fettsäuren 3 Zielstellung 4 Eigene Untersuchungen 4.1 Material 4.2 Methoden 4.2.1 Kultur P388D 1 und RAW264.7 4.2.2 Zusammensetzung der Zellkulturmedien 4.2.3 Anzüchtung 4.2.4 Dauerkultivierung P388D1 und RAW264.7 4.2.5 Einbaukontrolle der Fettsäuresupplementierung 4.2.6 Mycoplasmentest 4.2.7 Auswertung des Mycoplasmennachweis 4.2.8 Nachweis reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies 4.2.9 NADPH Oxidase-Nachweis 4.2.10 Stickstoffmonoxid-Test mittels Griess Reagenz 4.2.11 Nachweis der Induktion von iNOS 4.2.12 Bestimmung der Zytokine 4.2.13 Statistische Analyse 5 Ergebnisse 5.1 Publikation 1 5.2 Publikation 2 6 Diskussion 6.1 Verschiedene Makrophagen-Modelle und deren Eignung für die biochemische Forschung 6.2 Fettsäuremetabolismus von Makrophagen 6.3 Die Stimulation von Makrophagen und die dabei auftretenden Unterschiede zwischen RAW264.7 und P388D1 6.4 Auswirkung von unterschiedlichen Fettsäuresupplementierungen auf die Aktivität von Makrophagen 7 Schlussfolgerung 8 Zusammenfassung 9 Summary 10 Literaturverzeichnis 11 Anhang 11.1 Die Kultur von P388D 1 und RAW264.7 11.1.1 Gefrierkonservierung 11.1.2 Vitalitätstest mittels Trypanblau 11.2 Ergebnisse der NADPH Oxidase Aktiviät von P388D1 11.3 Materialien 11.3.1 Chemikalien 11.3.2 Verbrauchsmaterialien 11.3.3 verwendete Geräte 11.3.4 verwendete Puffer und Lösungen 11.3.5 verwendete Primer 11.3.6 verwendete Antikörper 12 Danksagun

Der Vergleich der Makrophagen-Zelllinien RAW264.7 und P388D1 hinsichtlich ihrer Eignung als Zellkulturmodell für den Einfluss mehrfach ungesättigter Fettsäuren

Einleitung: Makrophagen spielen eine vitale Rolle im angeborenen und adaptiven Immunsystem. Neben ihrer Rolle als Phagozyten bilden sie eine Reihe reaktiver Sauerstoff - und Stickstoff - Intermediate sowie immunmodulierender Zytokine. Ein wichtiger Faktor für die Makrophagen - Funktion ist die Ernährung, da sie unmittelbare Auswirkungen auf die Membranzusammensetzung hat. Hier gibt es einen direkten Zusammenhang zwischen Ernährung und Entzündung. Eine Untersuchung, die entsprechende Zusammenhänge im vergleichenden Makrophagen - Modell klar herausstellt, fehlt bislang. Ziele der Untersuchungen: Ziel dieser Studie war es, die Eignung zweier Zelllinien für die Analyse des Einflusses von mehrfach ungesättigten Fettsäuren auf verschiedene funktionelle und strukturelle Parameter von Makrophagen zu untersuchen. Material und Methoden: Die Kultur zweier permanenter Maus - Makrophagen - Zelllinien P388D1 und RAW264.7 in RPMI1640 erfolgte mit unterschiedlichen Fettsäuregehalten über 72 Stunden. Es wurden entweder 2μM LA (Linolsäure) und 15 μM LNA (Linolensäure) oder 15 μM LA und 2 μM LNA für die Anreicherung verwendet. Die Kontrolle wurde mit 2μM LA und 2μM LNA supplementiert. Die Fettsäureaufnahme und deren Metabolismus wurden gaschromatografisch bestimmt. Für die Analyse der NADPH - Oxidase - Aktivität wurden die Zellen mit PMA (Phorbol - Myristat - Azetat) stimuliert und die Extinktion von Nitroblautetrazolium gemessen. Als Negativkontrolle wurde DPI (Diphenyleniodoniumchlorid), ein NADPH - Oxidase - Inhibitor verwendet. Zur Analyse der Aktivität der iNOS (induzierbare - Stickstoffmonoxid - Synthase) sind die Zellen mit 50U IFN-γ (Interferron- Gamma) über 24h vorbereitet worden, um dann mit 1μg/μl LPS (Lipopolysaccharid) über weitere 24 h stimuliert zu werden. In den Überständen wurde nachfolgend Nitrit nachgewiesen. Die Messung der Expression der Induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase erfolgte mittels RT- PCR nach oben beschriebener Stimulation. Für die Analyse der Zytokine mit geeigneten murinen EILSA Kits wurden die Zellen wie oben beschrieben vorbereitet und stimuliert. TNF-α (Tumornekrosefaktor-alpha), IL-6 (Interleukin-6) und IL-10 (Interleukin-10) konnte so in den Überständen nachgewiesen werden. Die statistischen Auswertungen erfolgten als einfache Analyse der Varianz, gefolgt von einem Bonferroni-Test, um signifikante Unterschiede zwischen den Mittelwerten zu identifizieren. In allen Fällen wurde das Signifikanzniveau p< 0,05 angenommen. Ergebnisse: Alle Fettsäuren wurden von den Zellen aufgenommen, strukturell integriert u nd metabolisiert. Unter der Stimulation mit PMA kam es bei RAW264.7 zu einem signifikanten Anstieg der NADPH - Oxidase - Aktivität. Im Gegensatz dazu konnte bei P388D1 kein Effekt von PMA auf die Aktivität der NADPH-Oxidase-Aktivität nachgewiesen werden. Die Stickstoffmonoxid Produktion und die Induktion der iNOS konnten bei RAW264.7 durch Stimulation signifikant erhöht werden. In P388D1 war abseits der moderaten Induktion der iNOS keine Veränderung von NO (Stickstoffmonoxid) messbar. RAW264.7 zeigten eine signifikante Änderung der Gehalte an TNF-α, IL-6 und IL-10. P388D1 bildete ebenfalls moderat erhöht TNF-α und IL-6. Die Bildung von IL-10 konnte bei P388D1 jedoch nicht nachgewiesen werden. In der Linie RAW264.7 erhöhte LNA die NADPH-Oxidase-Aktivität signifikant gegenüber LA und der Kontrolle. LA und LNA bewirkten signifikant erhöhte Gehalte des Zytokins IL-10. Die Analyse von TNF-α und IL-6 ergab unter Einwirkung von LA und LNA reduzierte Gehalte beider Mediatoren. Schlussfolgerungen: In Summe zeigen die Versuche, dass sich die Zelllinie RAW264.7 für die Analyse von Vorgängen immunologischer, funktioneller und struktureller Parameter in Bezug auf unterschiedliche PUFA (mehrfach ungesättigte Fettsäuren) Supplementierungen besser eignen als P388D1. Ferner kann resümiert werden, das n3 Fettsäuren-reiche Versorgung einen positiven Einfluss auf die Reaktionsfähigkeit der Makrophagen in puncto Radikalbildung und antiinflammatorischer Wirkung zeigt.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Makrophagen 2.1.1 Entwicklung und Morphologie 2.1.2 Funktionelle und phänotypische Eigenschaften 2.2 Makrophagen-Zelllinien 2.2.1 RAW 264.7 2.2.2 P388 D1 2.3 Makrophagen-Stimulation 2.3.1 Phorbol-12-Myristat-13-Azetat 2.3.2 LPS 2.3.3 Interferon-γ 2.4 Reaktive Moleküle 2.5 Reaktive Sauerstoffspezies 2.5.1 Reaktive Sauerstoffspezies in Makrophagen 2.5.2 Enzymatische Bildung von ROS in Makrophagen 2.6 Wirkungen reaktiver Sauerstoffspezies 2.6.1 Phagozytose 2.6.2 Signalwirkung 2.7 Schutzmaßnahmen der Makrophagen gegenüber reaktiven Sauerstoffspezies 2.7.1 Katalase 2.7.2 Superoxid-Dismutase 2.7.3 Glutathion System 2.8 Reaktive Stickstoffspezies 2.8.1 Reaktive Stickstoffspezies in Makrophagen 2.8.2 Stickstoffmonoxid 2.8.3 Wirkungen reaktiver Stickstoffspezies 2.8.4 Schutzmaßnahmen der Zelle gegenüber reaktiven Stickstoffspezies 2.9 Langkettige Fettsäuren 2.9.1 Essenzielle Fettsäuren 2.9.2 Bedeutung mehrfach ungesättigter Fettsäuren 3 Zielstellung 4 Eigene Untersuchungen 4.1 Material 4.2 Methoden 4.2.1 Kultur P388D 1 und RAW264.7 4.2.2 Zusammensetzung der Zellkulturmedien 4.2.3 Anzüchtung 4.2.4 Dauerkultivierung P388D1 und RAW264.7 4.2.5 Einbaukontrolle der Fettsäuresupplementierung 4.2.6 Mycoplasmentest 4.2.7 Auswertung des Mycoplasmennachweis 4.2.8 Nachweis reaktiver Sauerstoff- und Stickstoffspezies 4.2.9 NADPH Oxidase-Nachweis 4.2.10 Stickstoffmonoxid-Test mittels Griess Reagenz 4.2.11 Nachweis der Induktion von iNOS 4.2.12 Bestimmung der Zytokine 4.2.13 Statistische Analyse 5 Ergebnisse 5.1 Publikation 1 5.2 Publikation 2 6 Diskussion 6.1 Verschiedene Makrophagen-Modelle und deren Eignung für die biochemische Forschung 6.2 Fettsäuremetabolismus von Makrophagen 6.3 Die Stimulation von Makrophagen und die dabei auftretenden Unterschiede zwischen RAW264.7 und P388D1 6.4 Auswirkung von unterschiedlichen Fettsäuresupplementierungen auf die Aktivität von Makrophagen 7 Schlussfolgerung 8 Zusammenfassung 9 Summary 10 Literaturverzeichnis 11 Anhang 11.1 Die Kultur von P388D 1 und RAW264.7 11.1.1 Gefrierkonservierung 11.1.2 Vitalitätstest mittels Trypanblau 11.2 Ergebnisse der NADPH Oxidase Aktiviät von P388D1 11.3 Materialien 11.3.1 Chemikalien 11.3.2 Verbrauchsmaterialien 11.3.3 verwendete Geräte 11.3.4 verwendete Puffer und Lösungen 11.3.5 verwendete Primer 11.3.6 verwendete Antikörper 12 Danksagun