BASI MOLECOLARI DELL'APPRENDIMENTO: IDENTIFICAZIONE DEI GENI DIFFERENZIALMENTE ESPRESSI NELLE REGIONI MEDIO-TEMPORALI DEL CERVELLO DI RATTO IN SEGUITO A "CONTEXTUAL FEAR CONDITIONING"

Questa tesi sperimentale fa parte di un progetto di ricerca finalizzato ad individuare i geni candidati ad essere differenzialmente espressi nelle strutture telencefaliche (ippocampo, amigdala e corteccia peririnale) coinvolte in processi di apprendimento, in ratti sottoposti al paradigma comportamentale del contextual fear conditioning. Molte informazioni sulla memoria e sull’apprendimento associativo derivano da studi di condizionamento classico svolti sia su vertebrati che invertebrati. Tale procedura implica la formazione di un’associazione tra stimoli e/o risposte, in quanto uno stimolo neutro chiamato stimolo condizionato (SC) è associato ad uno stimolo che normalmente evoca una risposta fisiologica chiamato stimolo incondizionato (SI). Accoppiando ripetutamente i due stimoli anche il solo stimolo condizionato è in grado di generare la risposta. Una forma di condizionamento classico è il condizionamento alla paura o classical fear conditioning, basato su processi neurali di apprendimento e memoria che permettono di rispondere in maniera efficace a stimoli, che altrimenti non indurrebbero risposte spostanee di paura. In tale paradigma comportamentale l’amigdala svolge un ruolo chiave indipendentemente dalle modalità sensoriali usate come CS. Anche l’ambiente dove viene presentato SI può assumere caratteristiche di SC inducendo risposte che vengono definite di paura condizionata al contesto. In questa forma di condizionamento al contesto, contextual fear conditioning, si ha l’attivazione dell’amigdala, della corteccia peririnale e soprattutto dell’ippocampo. Animali sottoposti al contextual fear conditioning mostrano una risposta comportamentale alla paura che è quella dell’immobilità o freezing ogni volta che sono inseriti nell’apparato di condizionamento (retrieval test). Registrazione elettrofisiologiche effettuate su slices di ippocampo di ratti condizionati evidenziano la comparsa di una forma più duratura di LTP (detta LTP tardiva), che dura almeno 24 ore e comporta la sintesi di nuovo mRNA il quale a sua volta può essere usato per ottenere cambiamenti strutturali persistenti. Per individuare i possibili geni coinvolti in tali modificazioni abbiamo utilizzato la tecnica dell’ibridazione sottrattiva soppressiva (suppression subtractive Hybridisation, SSH). L’SSH rappresenta un efficiente metodo che tramite la costruzione di librerie sottrattive di cDNA, permette l’isolamento di sequenze differenzialmente espresse in seguito al trattamento in esame. In particolare l’efficienza dell’SSH consiste nella capacità di isolare anche i trascritti più rari non evidenziabili con altre tecniche che evidenziano pattern di espressione genica. Nel test da noi utilizzato l’animale viene inserito nell’apparato di condizionamento, dopo tre minuti viene sottoposto ad un training di sette scosse elettriche (ciascuna dell’intensità di 1 mA e della durata di 1 secondo e intervallate 30 secondi l’una dall’altra), terminata la sessione di condizionamento l’animale resta nell’apparato di condizionamento per altri tre minuti e successivamente viene trasferito nella propria home box. A 48 ore di distanza dal condizionamento, i cervelli sia degli animali condizionati che dei controlli ( animali mai entrati nell’apparato di condizionamento) sono stati estratti e sezionati in tre parti: anteriore, medio-temporale ( ippocampo, amigdala e corteccia peririnale) e posteriore (cervelletto e bulbo). L’RNA poliA+ estratto dalle sezioni medio-temporali degli animali condizionati e dei controlli viene utilizzato per la costruzione delle librerie sottrattive di cDNA. Dopo aver valutato l’efficienza della sottrazione i cDNA vengono clonati e sottoposti a screening. Le sequenze dei cloni differenziali, ottenute con sequenziatore automatico, sono analizzate mediante comparazione con le sequenze depositate in banche dati tramite programmi come FASTA, BLASTIX e BLASTN. La reale espressione differenziale sarà poi analizzata mediante RT-PCR relativa

Improvement in cardiac energetics by perhexiline in heart failure due to dilated cardiomyopathy

Objectives: The aim of this study was to determine whether short-term treatment with perhexiline improves cardiac energetics, left ventricular function, and symptoms of heart failure by altering cardiac substrate utilization. Background: Perhexiline improves exercise capacity and left ventricular ejection fraction (LVEF) in patients with heart failure (HF). P cardiac magnetic resonance spectroscopy can be used to quantify the myocardial phosphocreatine/adenosine triphosphate ratio. Because improvement of HF syndrome can improve cardiac energetics secondarily, we investigated the effects of short-term perhexiline therapy. Methods: Patients with systolic HF of nonischemic etiology (n= 50, 62 ± 1.8 years of age, New York Heart Association functional class II to IV, LVEF: 27.0 ± 1.44%) were randomized to receive perhexiline 200 mg or placebo for 1 month in a double-blind fashion. Clinical assessment, echocardiography, and P cardiac magnetic resonance spectroscopy were performed at baseline and after 1 month. A substudy of 22 patients also underwent cross-heart blood sampling at completion of the study to quantify metabolite utilization. Results: Perhexiline therapy was associated with a 30% increase in the phosphocreatine/adenosine triphosphate ratio (from 1.16 ± 0.39 to 1.51 ± 0.51; p< 0.001) versus a 3% decrease with placebo (from 1.36 ± 0.31 to 1.34 ± 0.31; p=0.37). Perhexiline therapy also led to an improvement in New York Heart Association functional class compared with placebo (p= 0.036). Short-term perhexiline therapy did not change LVEF. Cross-heart measures of cardiac substrate uptake and respiratory exchange ratio (which reflects the ratio of substrates used) did not differ between patients who received perhexiline versus placebo. Conclusions: Perhexiline improves cardiac energetics and symptom status with no evidence of altered cardiac substrate utilization. No change in LVEF is seen at this early stage. (Metabolic Manipulation in Chronic Heart Failure; NCT00841139)

The mitochondrial metabolic reprogramming agent trimetazidine as an 'exercise mimetic' in cachectic C26-bearing mice.

BACKGROUND: Cancer cachexia is characterized by muscle depletion and exercise intolerance caused by an imbalance between protein synthesis and degradation and by impaired myogenesis. Myofibre metabolic efficiency is crucial so as to assure optimal muscle function. Some drugs are able to reprogram cell metabolism and, in some cases, to enhance metabolic efficiency. Based on these premises, we chose to investigate the ability of the metabolic modulator trimetazidine (TMZ) to counteract skeletal muscle dysfunctions and wasting occurring in cancer cachexia. METHODS: For this purpose, we used mice bearing the C26 colon carcinoma as a model of cancer cachexia. Mice received 5 mg/kg TMZ (i.p.) once a day for 12 consecutive days. A forelimb grip strength test was performed and tibialis anterior, and gastrocnemius muscles were excised for analysis. Ex vivo measurement of skeletal muscle contractile properties was also performed. RESULTS: Our data showed that TMZ induces some effects typically achieved through exercise, among which is grip strength increase, an enhanced fast-to slow myofibre phenotype shift, reduced glycaemia, PGC1α up-regulation, oxidative metabolism, and mitochondrial biogenesis. TMZ also partially restores the myofibre cross-sectional area in C26-bearing mice, while modulation of autophagy and apoptosis were excluded as mediators of TMZ effects. CONCLUSIONS: In conclusion, our data show that TMZ acts like an 'exercise mimetic' and is able to enhance some mechanisms of adaptation to stress in cancer cachexia. This makes the modulation of the metabolism, and in particular TMZ, a suitable candidate for a therapeutic rehabilitative protocol design, particularly considering that TMZ has already been approved for clinical use

Bcl-2–Modifying Factor Induces Renal Proximal Tubular Cell Apoptosis in Diabetic Mice

This study investigated the mechanisms underlying tubular apoptosis in diabetes by identifying proapoptotic genes that are differentially upregulated by reactive oxygen species in renal proximal tubular cells (RPTCs) in models of diabetes. Total RNAs isolated from renal proximal tubules (RPTs) of 20-week-old heterozygous db/m+, db/db, and db/db catalase (CAT)-transgenic (Tg) mice were used for DNA chip microarray analysis. Real-time quantitative PCR assays, immunohistochemistry, and mice rendered diabetic with streptozotocin were used to validate the proapoptotic gene expression in RPTs. Cultured rat RPTCs were used to confirm the apoptotic activity and regulation of proapoptotic gene expression. Additionally, studies in kidney tissues from patients with and without diabetes were used to confirm enhanced proapoptotic gene expression in RPTs. Bcl-2–modifying factor (Bmf) was differentially upregulated (P < 0.01) in RPTs of db/db mice compared with db/m+ and db/db CAT-Tg mice and in RPTs of streptozotocin-induced diabetic mice in which insulin reversed this finding. In vitro, Bmf cDNA overexpression in rat RPTCs coimmunoprecipated with Bcl-2, enhanced caspase-3 activity, and promoted apoptosis. High glucose (25 mmol/L) induced Bmf mRNA expression in RPTCs, whereas rotenone, catalase, diphenylene iodinium, and apocynin decreased it. Knockdown of Bmf with small interfering RNA reduced high glucose–induced apoptosis in RPTCs. More important, enhanced Bmf expression was detected in RPTs of kidneys from patients with diabetes. These data demonstrate differential upregulation of Bmf in diabetic RPTs and suggest a potential role for Bmf in regulating RPTC apoptosis and tubular atrophy in diabetes

Present and future pharmacotherapeutic agents in heart failure: an evolving paradigm

Many conditions culminate in heart failure (HF), a multi-organ systemic syndrome with an intrinsically poor prognosis. Pharmacotherapeutic agents that correct neurohormonal dysregulation and haemodynamic instability have occupied the forefront of developments within the treatment of HF in the past. Indeed, multiple trials aimed to validate these agents in the 1980s and early 1990s, resulting in a large and robust evidence-base supporting their use clinically. An established treatment paradigm now exists for the treatment of HF with reduced ejection fraction (HFrEF), but there have been very few notable developments in recent years. HF remains a significant health concern with an increasing incidence as the population ages. We may indeed be entering the surgical era for HF treatment, but these therapies remain expensive and inaccessible to many. Newer pharmacotherapeutic agents are slowly emerging, many targeting alternative therapeutic pathways, but with mixed results. Metabolic modulation and manipulation of the nitrate/nitrite/nitric oxide pathway have shown promise and could provide the answers to fill the therapeutic gap between medical interventions and surgery, but further definitive trials are warranted. We review the significant evidence base behind the current medical treatments for HFrEF, the physiology of metabolic impairment in HF, and discuss two promising novel agents, perhexiline and nitrite

INTELLIGENZA ARTIFICIALE E RESPONSABILITÀ: TRA DIRITTO CIVILE E DIRITTO PENALE

Il presente lavoro verte sui problemi ascrittivi della responsabilità penale nell’ordinamento italiano, in relazione agli eventi lesivi che coinvolgono sistemi di intelligenza artificiale (c.d. sistemi di i.a.). L’obiettivo è di verificare se i tradizionali regimi di responsabilità penale – che hanno come presupposto la commissione di fatti penalmente rilevanti da parte di persone fisiche – siano adeguati al nuovo contesto tecnologico, in cui algoritmi caratterizzati da autonomia, interattività e opacità (c.d. black box) possono porre in essere condotte imprevedibili dagli utilizzatori e dagli stessi produttori. Chi risponde, allora, degli incidenti mortali cagionati da una self driving car? Chi è colpevole per una manipolazione del mercato realizzata da un sistema di trading algoritmico? Nel corso del nostro lavoro, ci concentreremo sia sui profili di responsabilità attinenti alla posizione del produttore, sia su quelli attinenti l’utilizzatore. Nel diritto civile – cui dedichiamo il secondo capitolo – sono prospettabili diverse soluzioni per offrire ristoro economico alla persona danneggiata dai sistemi di i.a., fondate, da un lato, su semplificazioni probatorie in materia di accertamento del nesso di causalità, e, dall’altro lato, su criteri di imputazione lato sensu oggettivi, contenuti nel codice civile (artt. 2049-2054 c.c.) e nella legislazione speciale (dir. 85/374/CE e artt. 114-127 cod. cons. sulla responsabilità del produttore). Sebbene non manchino le questioni problematiche e le necessità di adattamento dei regimi esistenti, la responsabilità aquiliana si conferma uno strumento duttile, capace di adattarsi ai nuovi fenomeni tecnologici. Di contro, le garanzie che circondano il sistema costituzionale del diritto penale (prime tra tutte: legalità, offensività, colpevolezza, presunzione di innocenza) lo rendono un diritto rigido, inidoneo a contenere quei fenomeni sistemici, globalizzati ed incerti che caratterizzano la post modernità. In particolare, l’interposizione tra l’imperscrutabile decision making algoritmico e la condotta dell’utilizzatore o del produttore pone un problema, innanzitutto, con riferimento all’accertamento del nesso di causalità, stante l’assenza, attualmente, di leggi scientifiche di copertura in grado di spiegare il comportamento dei dispositivi intelligenti. La crisi del modello nomologico-deduttivo si ripercuote, poi, a cascata, sull’intera struttura del reato e, in particolare, sull’accertamento della colpa. Lo sviluppo di sistemi di i.a. – caratterizzati da un’imprevedibilità genericamente prevedibile – parrebbe infatti mettere in discussione la stessa possibilità di muovere un rimprovero colposo al produttore e all’utilizzatore, se si considera che, secondo il criterio di copertura del rischio tipico, l’evento lesivo è rimproverabile all’agente soltanto se esso costituisce realizzazione tipica del rischio che la norma cautelare mirava a prevenire. Stante, dunque, la difficoltà di configurare una responsabilità penale per il danno derivante da dispositivo intelligente, il presente lavoro si concentra infine sulla possibilità di fare ricorso a tecniche di anticipazione della tutela penale, sia in una prospettiva de jure condito, sia in una prospettiva de jure condendo.This dissertation aims at framing the problem of criminal liability, in the Italian legal framework, for harms committed by means of Artificial Intelligence systems (hereinafter ‘AI systems’). This kind of incidents could undermine existing liability models based on negligence, which are shaped around human actions and require a culpable mental state. As AI systems become increasingly autonomous and able to learn new skills and adapt to the context around them, they are expected to act in ways that its designers and developers have no way to foresee. Who is to blame if an AI system causes serious harm to individuals or property? This dissertation will focus on both manufacturers and users’ liability. In Civil law, there are different solutions that are available or that could be devised to deal with artificial intelligence damages. These solutions are mostly based on strict liability regimes, which are provided in the Italian Civil Code (Articles 2049-2054) and in the complementary legislation (Directive 85/374/EEC and Articles 114-127 of the Italian Consumer Code). On the contrary, the guarantees surrounding the constitutional system of Criminal law (first and foremost: principles of actus reus and mens rea; presumption of innocence) make this sector of law unsuitable for managing those systemic, globalised and uncertain phenomena that characterise post-modernity. On the one hand, the interposition between the inscrutable algorithmic decision-making and the conduct of the user or producer poses a problem with reference to causation, because there is no scientific understanding of the AI systems’ behaviour. On the other hand, it is questionable if the producer and the user could be considered negligent: the unpredictability of AI systems is generically foreseeable, but the criminal negligence requires that the foreseeability concerns the specific harm that occurred in the concrete case. Given the difficulty with establishing criminal liability for AI damages, this dissertation finally focuses on the possible introduction of new negligence crimes centered around the improper design, operation, and testing of AI applications

Structure-borne noise of marine diesel engines: transfer-path analysis of onboard transmission and underwater radiation

Onboard machinery generates structure-borne noise that propagates onboard and underwater. Structure-borne noise has a direct influence on the onboard noise comfort and the underwater noise footprint of the vessel. Vibrational transfer-path analysis (TPA) can be used to understand how noise is transmitted from onboard noise sources to the ship structures or radiated underwater. The focus of this research is on the noise radiated from resiliently-mounted marine diesel engines because of their dominant impact on the noise signature of the vessel. With TPA, the main components of the vibrational transfer path are analyzed separately and then combined together. Noise levels at the receiver can be reduced by identifying the critical points in the transfer path and improving their design. The characterization of the vibration isolator mounted under the diesel engine is performed with the use of numerical models built and validated with the aid of experimental tests and response surface methodology (RSM). Similarly, a finite-element model for the analysis of underwater sound radiation of vibrating structures is developed using sound and vibration measurements acquired with acoustic measurements in a water tank. This work presents an experimental procedure for the characterization of the vibration isolator at different static preloads. The dynamic response of a numerical simulation is fit to the experimental response using a hyperelastic material model and an implicit timeintegration scheme. Moreover, the coupled acoustic-structural analysis of the underwater radiation yields accurate results and provides a coefficient of sound radiation (σ). An analytical formulation of the transfer path is developed to combine the contributions of the components of the transfer path to estimate noise and vibration levels at the receiving point. This thesis highlights the importance of numerical models in the TPA of structure-borne noise and shows how dynamic simulations can help ship designers estimate the contribution of the components of the transfer path using standardized testing procedures and model-scale experiments